本文選題：阿爾茨海默病 + 淀粉樣前體蛋白��； 參考：《重慶醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：背景:阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種以進行性的認知障礙、記憶力減退和性格行為改變等癥狀為主的影響老年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD由于嚴重影響患者的生活能力,重癥患者甚至日常生活不能自理,給患者家庭和整個社會帶來沉重的經(jīng)濟和社會負擔。AD的典型特征是在腦中沉積的β-淀粉樣蛋白(β-Amyloid peptide,Aβ),Aβ是通過淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)的蛋白裂解產(chǎn)生。眾多證據(jù)表明線粒體的功能異常對AD的發(fā)病起到了關(guān)鍵作用。體內(nèi)和體外研究支持線粒體在APP代謝和細胞轉(zhuǎn)運中起的重要作用。近年來,作為線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子家族成員之一的線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子4(mitochondrial transcription termination factor 4,MTERF4)被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)節(jié)線粒體DNA轉(zhuǎn)錄和直接控制線粒體核糖體翻譯的功能。MTERF4可能通過對線粒體功能的調(diào)節(jié)因而和AD的發(fā)病相關(guān)。目的:本研究觀察MTERF4在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織中的表達情況,進一步研究MTERF4過表達與敲低在體外對APP代謝途徑的影響與機制,揭示MTERF4在AD發(fā)病機制中的作用。方法:利用Western blot技術(shù)檢測MTERF4在6月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中及同月齡野生對照小鼠海馬組織中的表達情況。用分子克隆技術(shù),構(gòu)建pc DNA-MTERF4真核表達載體和p GPH1/GFP/Neo-MTERF4干擾載體。培養(yǎng)HEK293-APPswe細胞,分別將構(gòu)建的過表達載體和RNA干擾載體轉(zhuǎn)染細胞,采用Western blot技術(shù)檢測細胞中MTERF4、APP、C99、C83、ADAM10和BACE1的蛋白表達水平。用Trizol法提取細胞的總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成c DNA后進行實時熒光定量PCR檢測,觀察MTERF4、APP、ADAM10和BACE1基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達。構(gòu)建含有ADAM10啟動子序列的熒光素酶報告基因質(zhì)粒p GL3-ADAM10,將pc DNA-MTERF4與p GL3-ADAM10共轉(zhuǎn)染到HEK293細胞中,用海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參,通過對重組質(zhì)粒表達熒光素酶活性的分析,確定過表達MTERF4對ADAM10基因啟動子活性的影響。應用酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)來檢測分泌到細胞外的Aβ42的生成量。采用流式細胞技術(shù)檢測MTERF4過表達與敲低時的細胞周期情況。CCK-8法檢測MTERF4過表達與敲低對HEK293-APPswe細胞增殖的影響。結(jié)果:Western blot結(jié)果顯示在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬組織中MTERF4蛋白表達水平增加68%。成功構(gòu)建針對MTERF4基因的pc DNA-MTERF4過表達載體和p GPH1/GFP/Neo-MTERF4干擾載體。與對照組相比,將重組質(zhì)粒pc DNA-MTERF4瞬時轉(zhuǎn)染到HEK293-APPswe細胞24和48小時,MTERF4蛋白水平分別顯著增加了67%和258%。實時定量PCR結(jié)果顯示,pc DNA-MTERF4轉(zhuǎn)染的細胞中MTERF4 m RNA水平在24和48小時增加235和216倍。MTERF4的過表達誘導了HEK293-APPswe細胞中APP蛋白和胞外分泌的Aβ42水平的顯著增加。另外,APP蛋白切割加工產(chǎn)生的C99水平升高37%、C83水平降低27%,表明MTERF4過表達抑制了APP蛋白的α-切割而促進了β切割。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,MTERF4過表達組細胞中的ADAM10 m RNA水平在轉(zhuǎn)染48小時后降低68%。Western blot檢測顯示MTERF4的過表達抑制ADAM10的蛋白表達(下降27%)。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示過表達MTERF4蛋白可抑制ADAM10基因啟動子區(qū)域的啟動子活性。MTERF4過表達不影響HEK293-APPswe細胞的周期分布和細胞增殖。在HEK293-APPswe細胞中利用p GPH1/GFP/Neo-MTERF4質(zhì)粒干擾MTERF4基因的表達。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293-APPswe細胞24和48小時,MTERF4蛋白水平分別降低了9%和36%。定量實時PCR結(jié)果顯示,MTERF4敲低的細胞中MTERF4 m RNA水平在24和48小時降低19%和66%。與對照組相比,敲低MTERF4 48小時后細胞中APP蛋白表達水平降低26%,胞外Aβ42水平降低24%。同時APP代謝產(chǎn)物C99和C83水平分別降低19%和32%。干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞48h后,細胞中ADAM10蛋白水平降低了26%,而在24小時細胞中ADAM10蛋白水平無明顯變化。與對照組相比,在MTERF4敲低24和48小時后,細胞中ADAM10 m RNA表達分別降低21%和51%。敲低MTERF4 24和48小時,細胞周期在G0/G1期的細胞百分比減少、S期細胞百分比增加,G2/M期細胞百分比無明顯差異。干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞48h后,與對照組相比較細胞增殖降低11%。結(jié)論:MTERF4蛋白表達在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織中上調(diào)。在體外該基因過表達增加了HEK293-APPswe細胞中APP蛋白水平并通過抑制α-分泌酶ADAM10促進APP的淀粉樣蛋白形成加工。敲低MTERF4表達則通過抑制細胞中APP表達降低淀粉樣蛋白形成加工,并對APP和ADAM10基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平都具有下調(diào)作用。另外,敲低MTERF4表達對細胞周期和細胞增殖具有一定的影響。這些結(jié)果表明MTERF4對引發(fā)AD的APP表達及代謝通路具有調(diào)控作用,兩者呈正相關(guān)關(guān)系。MTERF4可能在AD的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用,該機制為探索AD的治療方法提供了新思路。
[Abstract]:BACKGROUND : Alzheimer ' s disease ( AD ) is a kind of degenerative disease of the central nervous system affected by progressive cognitive impairment , hypomnesis , and change of personality behavior . Western blot analysis showed that MTERF4 overexpression inhibited the expression of MTERF4 in 24 and 48 hours after transfection .
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R749.16

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6 李e，

本文編號：2028708