發(fā)布時間：2018-05-31 13:41

  本文選題：常春藤皂甙元 + H22肝癌�。� 參考：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：肝細胞癌(Hepatocellμlar Carcinoma,HCC)(簡稱肝癌)的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排在第二位,僅次于肺癌,其發(fā)病率因地區(qū)不同而有所差異,發(fā)達國家明顯低于發(fā)展中國家,亞洲國家的發(fā)病率高于美國和西歐國家,在我國其發(fā)病率已超過25/10萬,其中高發(fā)區(qū)之肝癌標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率達49.17/10萬人口。據(jù)統(tǒng)計,我國每年新增近30余萬肝癌患者,占全世界每年新增肝癌患者的一半。另外,我國每年死于肝癌的病人約為30萬人,患者5年生存率僅為2.7%。肝癌患病一般不易察覺、且發(fā)展迅速,患者的生存期短、后期生存質(zhì)量較差。早期肝癌的治療以手術(shù)治療為首選并輔以放射療法和或化學(xué)療法;中晚期肝癌及轉(zhuǎn)移性肝癌以放射療法和或化學(xué)療法為主,一般不建議手術(shù)。近年來,隨著中藥抗腫瘤研究的興起,天然植物藥在癌癥治療中受到了廣泛的關(guān)注。在前期研究工作中,筆者曾對八月札水提物的抗肝癌作用進行了初步的研究,發(fā)現(xiàn)其能夠明顯降低H22荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤的重量,對肝癌細胞的生長和增殖具有顯著的抑制作用。同時,八月札水提物還能夠顯著提高H22荷瘤小鼠的免疫水平,提高機體抗氧化應(yīng)激、清除自由基和維持內(nèi)環(huán)境活性氧動態(tài)平衡的能力。由此推測,八月札水提物可能通過誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡和上調(diào)機體免疫水平而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究將八月札的主效成份常春藤皂甙元(Hederagenin,HD)作為研究對象,并通過H22荷瘤小鼠體內(nèi)試驗和Hep G2細胞體外培養(yǎng)試驗,應(yīng)用MTT、RT-PCR、免疫熒光、Western Blot、AO/EB凋亡染色、Hoechst33342凋亡染色、酶聯(lián)免疫吸附試驗、NK細胞活性檢測以及流式細胞術(shù)等方法,試圖探討HD抗肝癌作用及在腫瘤細胞調(diào)控、誘導(dǎo)細胞凋亡和免疫調(diào)節(jié)等方面的作用及相關(guān)機制,并獲得如下結(jié)果。1.在HD對H22荷瘤小鼠抗肝癌作用的研究中,首先建立H22荷瘤小鼠模型,隨機分為5組,每組12只,即對照組、環(huán)磷酰胺(CTX)陽性對照組、HD低劑量組(100mg/Kg)、HD中劑量組(200 mg/Kg)和HD高劑量組(400 mg/Kg)。經(jīng)不同劑量的HD連續(xù)干預(yù)H22荷瘤小鼠14 d后,可觀察到H22荷瘤鼠腫瘤組織的生長和增殖受到明顯的抑制,小鼠的生存狀態(tài)和生命體征與對照組比較得到明顯的改善。HD各試驗組(100mg/Kg、200 mg/Kg和400 mg/Kg)均能顯著地抑制H22荷瘤小鼠腫瘤的生長(P0.01),腫瘤抑制率分別為29.67%、42.75%和40.26%。通過HE染色觀察H22荷瘤小鼠肝臟和腎臟的組織結(jié)構(gòu),以及對肝和腎功能相關(guān)指標(biāo)的檢測,發(fā)現(xiàn)HD對小鼠無明顯的毒副作用。通過免疫熒光法檢測各試驗組H22荷瘤小鼠腫瘤組織中突變型P53、P21和Bcl-2蛋白的表達情況,研究結(jié)果顯示,對照組小鼠的腫瘤組織中突變型P53和Bcl-2蛋白呈高表達,而P21蛋白則相反呈現(xiàn)低表達。經(jīng)HD和CTX處理后的小鼠腫瘤組織中突變型P53和Bcl-2蛋白的表達顯著降低(P0.01),而P21蛋白的表達則顯著升高(P0.01)。以上結(jié)果揭示HD可能通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。2.在HD誘導(dǎo)H22荷瘤小鼠腫瘤細胞凋亡作用研究中,應(yīng)用免疫熒光、RT-PCR和Western blot等技術(shù),對腫瘤組織中Bcl-2、Bax、Fas、Fasl、Caspase-3和Caspase-8基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達進行了研究。與對照組比較,HD各試驗組H22荷瘤小鼠腫瘤組織細胞中Bcl-2在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達均顯著降低(P0.01),而Bax、Fas、Fas L、Caspase-3、Caspase-8在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達均顯著升高(P0.01)。以上結(jié)果揭示HD可能通過激活細胞凋亡的線粒體途徑和死亡受體途徑誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。3.在HD對H22荷瘤小鼠免疫功能的影響研究中,通過分析HD治療前后小鼠免疫器官組織結(jié)構(gòu)和功能的變化,發(fā)現(xiàn)HD各試驗組均可以明顯的改善H22荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)(P0.05),初步判定HD能夠促進H22荷瘤小鼠胸腺和脾臟兩大免疫器官的修復(fù)。同時,HD能夠顯著提高H22荷瘤小鼠脾淋巴細胞的增殖能力(P0.01),顯著提高小鼠免疫器官中的NK細胞的殺傷能力(P0.05);HD能夠顯著增加CD4+T淋巴細胞的數(shù)量,提升CD4+/CD8+的比值(P0.05),表明HD能通過調(diào)節(jié)T淋巴細胞亞群的數(shù)目和比例進而改善細胞免疫應(yīng)答。另外,HD還能夠調(diào)節(jié)H22荷瘤小鼠外周血中IL-2和TNF-α的表達水平,尤其HD 200 mg/Kg和400 mg/Kg組作用顯著(P0.05)。以上結(jié)果揭示HD可能通過修復(fù)免疫器官、調(diào)控細胞免疫應(yīng)答和改善細胞因子水平而發(fā)揮抗腫瘤作用。4.在HD體外抑制Hep G2細胞作用的研究中,經(jīng)不同濃度的HD(濃度為0、30、60、90、120和180μg/m L)干預(yù)Hep G2細胞24 h和48 h后,HD對Hep G2細胞增殖的抑制作用不斷增強,并呈劑量時間依賴關(guān)系。HD各試驗組對Hep G2細胞的生長和增殖均表現(xiàn)出顯著的抑制作用,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);24 h的抑制率分別為5.26%、8.73%、11.00%、16.44%和27.72%;48 h的抑制率分別為1.80%、11.01%、19.38%、27.76%和42.01%。經(jīng)HE染色和激光共聚焦檢測,HD干預(yù)48 h后,Hep G2細胞呈煎蛋樣改變,出現(xiàn)膜小泡和凋亡小體,核染色質(zhì)分布不均勻,并且核膜破損,呈典型的細胞凋亡形態(tài)學(xué)改變。另外,通過Annexin V FITC雙染觀察,經(jīng)HD處理48 h后,Hep G2細胞出現(xiàn)明顯的細胞凋亡現(xiàn)象,進一步證明了HD能夠誘導(dǎo)Hep G2細胞發(fā)生凋亡。當(dāng)濃度為120和180μg/m L時,HD誘導(dǎo)Hep G2細胞的發(fā)生凋亡的百分比分別為12.10%和17.90%,顯著高于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。以上結(jié)果揭示HD可能是通過誘導(dǎo)Hep G2細胞凋亡而發(fā)揮其抗肝癌作用。5.在HD體外誘導(dǎo)Hep G2細胞凋亡機制的研究中,應(yīng)用免疫熒光和Western blot技術(shù),對Hep G2細胞中突變型P53、Bcl-2、Bax、Fas、Fasl、Caspase-3和Caspase-8的表達變化情況進行研究。與對照組比較,經(jīng)HD處理的Hep G2細胞中突變型P53和Bcl-2蛋白的表達水平明顯降低(P0.01),而Bax、Fas、Fasl、Caspase-3和Caspase-8蛋白的表達顯著升高(P0.01),進一步表明HD誘導(dǎo)Hep G2凋亡作用可能與其激活細胞凋亡的線粒體途徑和死亡受體途徑密切相關(guān)。本研究通過動物模型體內(nèi)試驗和細胞培養(yǎng)體外試驗兩個途徑,探討了HD對H22荷瘤小鼠和Hep G2細胞的抗腫瘤作用及相關(guān)機制,通過藥理學(xué)、病理學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等相關(guān)技術(shù)和方法,對與腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)的細胞因子、m RNA、蛋白和細胞凋亡(細胞凋亡相關(guān)調(diào)控通路)等指標(biāo)進行了系統(tǒng)的檢測和分析,證實HD在體內(nèi)和體外均具有明顯的抑制腫瘤細胞生長和增殖的作用,這可能與HD能夠激活細胞凋亡的線粒體途徑和死亡受體途徑密切相關(guān),通過本研究可以為臨床使用HD協(xié)助治療肝癌提供理論和試驗依據(jù)。
[Abstract]:The incidence of hepatocellular carcinoma ( HCC ) is second in all malignant tumors , secondary to lung cancer . The incidence of hepatocellular carcinoma is higher than that in developing countries . The incidence rate of HCC in China is higher than that in developing countries . In recent years , the incidence of hepatocellular carcinoma in China has been higher than that in the United States and Western European countries . Each group was randomly divided into 5 groups , i.e . control group , cyclophosphamide ( CTX ) positive control group , HD low - dose group ( 100mg / Kg ) , HD middle - dose group ( 200 mg / Kg ) and HD high - dose group ( 400 mg / Kg ) . The expression of Bcl - 2 , Bax , Fas , FasL , Caspase - 3 and Caspase - 8 in tumor tissues of mice bearing tumor bearing tumor was significantly decreased ( P0.01 ) . The results showed that HD could significantly improve the expression of Bcl - 2 , Bax , Fas , Fasl , Caspase - 3 and Caspase - 8 in tumor tissues of mice bearing tumor cells . 緇忎笉鍚屾祿搴︾殑HD(嫻撳害涓，

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