本文選題：卵巢透明細(xì)胞癌 + 賴氨酰氧化酶��； 參考：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究背景:卵巢癌是婦科常見的生殖道惡性腫瘤,死亡率居婦科腫瘤之首,嚴(yán)重威脅了廣大女性的健康和生命。疾病的早期診斷困難以及復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移所致的治療手段缺乏,是卵巢癌死亡率居高不下的主要原因。卵巢透明細(xì)胞腫瘤是上皮性卵巢腫瘤中的一種,絕大部分為惡性腫瘤,約占卵巢上皮性癌的5%,在東方女性中較西方更為常見。卵巢透明細(xì)胞癌雖較少見,但因具有對化療不敏感、易耐藥、早期復(fù)發(fā)、預(yù)后差的特點,引起了婦科腫瘤研究者的廣泛關(guān)注。賴氨酰氧化酶(Lysyl oxidase,LOX)是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)中催化膠原與彈性蛋白聚合的關(guān)鍵酶。研究表明LOX可調(diào)節(jié)細(xì)胞移動,參與基因調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化、生長調(diào)控及促使正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化等。近期研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,細(xì)胞的分化、生長控制、黏附性、活性、惡性轉(zhuǎn)化及侵襲性等均與細(xì)胞外基質(zhì)中LOX的異常表達(dá)密切相關(guān)。目前認(rèn)為LOX可能具有雙重作用,既是腫瘤抑制因子,同時也很可能是腫瘤轉(zhuǎn)移的促進(jìn)因子。之前很多文獻(xiàn)報道LOX在不同類型的腫瘤細(xì)胞系和原發(fā)性腫瘤中的表達(dá)出現(xiàn)紊亂,令人感興趣的是,LOX在不同類型腫瘤中表達(dá)改變也不相同,在病理狀態(tài)下LOX的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)的情況均有報道。然而,LOX在卵巢癌中,尤其是卵巢透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及生物學(xué)功能仍不明確。microRNA是一類內(nèi)源性、非編碼、單鏈小分子RNA,通過促進(jìn)靶基因mRNA降解和(或)抑制其翻譯,在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)的作用。microRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),其異常表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無限增殖、凋亡抑制,并促進(jìn)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移,同時也是腫瘤細(xì)胞間質(zhì)重塑和腫瘤血管生成的重要因素。研究表明microRNA具有很好的組織特異性,并且其表達(dá)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個階段也具有差異性,這提示我們可以使用microRNA作為腫瘤早期診斷及病情監(jiān)測的標(biāo)志物。近年來,關(guān)于卵巢癌中microRNA功能的研究越來越多。結(jié)論表明,多種microRNA參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展。有些是作為原癌基因發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移的作用,而有些則作為抑癌基因發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。通過生物信息學(xué)預(yù)測,我們發(fā)現(xiàn)miR-29b可能是能夠轉(zhuǎn)錄后調(diào)控LOX的microRNA。現(xiàn)有研究表明,miR-29b的表達(dá)在乳腺癌,肝癌,前列腺癌等多種腫瘤中均呈不同程度下調(diào),并且參與了結(jié)腸腺瘤向結(jié)腸癌發(fā)展的早期過程,提示miR-29b在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中可能作為抑癌因子發(fā)揮作用。另有研究發(fā)現(xiàn),miR-29家族與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切,通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡促進(jìn)乳腺癌和結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展,也可在膽管癌細(xì)胞中通過抑制Mcl-1的表達(dá)增加細(xì)胞對TRAIL的凋亡敏感性,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。目前miR-29的研究已涉及多種腫瘤,microRNA表達(dá)譜顯示,miR-29在卵巢癌中失調(diào)表達(dá),但其發(fā)揮生物學(xué)功能的具體分子生物學(xué)機(jī)制仍不清楚。綜上所述,研究LOX在卵巢透明細(xì)胞癌中的功能,篩選出在卵巢透明細(xì)胞癌中能夠?qū)OX作為靶基因的microRNA,并探究其發(fā)揮生物學(xué)功能的機(jī)制,將為LOX有可能成為卵巢透明細(xì)胞癌治療和預(yù)防轉(zhuǎn)移的新靶點提供理論基礎(chǔ)。研究目的:(1)檢測卵巢透明細(xì)胞癌組織、癌旁組織以及多種卵巢癌的細(xì)胞系中LOX的表達(dá)。(2)檢測過表達(dá)LOX對卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖能力和侵襲能力的影響,確定LOX的生物學(xué)功能。(3)篩選并證實在卵巢透明細(xì)胞癌中能夠調(diào)控LOX的microRNA,并分析其與LOX表達(dá)量之間的關(guān)系。(4)檢測miR-29b異常表達(dá)對卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖能力和侵襲能力的影響。研究方法:1.收集27例外科切除手術(shù)所得的卵巢透明細(xì)胞癌組織及癌旁組織標(biāo)本,使用免疫組化法對癌組織標(biāo)本及癌旁組織標(biāo)本中LOX的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測,統(tǒng)計分析不同組織中LOX的陽性表達(dá)率,進(jìn)行分析。此外,體外培養(yǎng)多種卵巢癌細(xì)胞系,例如人卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞ES-2,人卵巢上皮細(xì)胞癌細(xì)胞OV-1063,人卵巢腺癌細(xì)胞SKOV3和人卵巢腺癌細(xì)胞OVCAR-3,以正常卵巢上皮細(xì)胞為陰性對照,使用Western blot法檢測細(xì)胞中LOX的蛋白表達(dá)水平。2.將LOX的編碼區(qū)構(gòu)建到pcDNA3骨架質(zhì)粒上,建立pcDNA3-LOX過表達(dá)質(zhì)粒,并將該過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至ES-2細(xì)胞中,用Western blot法驗證過表達(dá)效率。瞬時轉(zhuǎn)染LOX過表達(dá)質(zhì)粒24小時(24 h)、48小時(48 h)和72小時(72h)后,使用CCK-8法檢測過表達(dá)LOX對細(xì)胞增殖能力的影響。瞬時轉(zhuǎn)染LOX過表達(dá)質(zhì)粒48 h后,使用Transwell法檢測過表達(dá)LOX對細(xì)胞侵襲能力的影響。3.通過生物信息學(xué)網(wǎng)站Targetscan尋找并篩選可能的microRNA。使用實時定量PCR法對ES-2,OV-1063,SKOV3和OVCAR-3幾種卵巢癌細(xì)胞中miR-29b的表達(dá)譜進(jìn)行檢測,并與LOX的表達(dá)譜進(jìn)行比較,進(jìn)一步明確miR-29b與LOX表達(dá)之間的關(guān)系。將LOX基因m RNA 3'UTR區(qū)構(gòu)建到pMIR-REPORTTM質(zhì)粒上形成Luc-LOX3'UTRWT質(zhì)粒,進(jìn)行熒光素酶報告實驗,并將Luc-LOX3'UTR WT質(zhì)粒上與miR-29b互補(bǔ)配對的位點進(jìn)行突變,成為Luc-LOX 3'UTR Mut質(zhì)粒,與正常的Luc-LOX 3'UTR質(zhì)粒組進(jìn)行比較,明確LOX是否為miR-29b的靶基因。使用Western blot法檢測改變miR-29b的表達(dá)水平是否能夠影響內(nèi)源性LOX蛋白白的表達(dá)水平。4.將miR-29b激動劑Mimics、miR-29b抑制劑Inhibitor以及陰性對照Scramble轉(zhuǎn)染至ES-2細(xì)胞中,并用實時定量PCR法驗證過表達(dá)和敲低效率。使用CCK-8法檢測Mimics組、Inhibitor組及Scramble組中細(xì)胞增殖能力的改變。使用Transwell法檢測Mimics組、Inhibitor組及Scramble組中細(xì)胞侵襲能力的改變。結(jié)果:1.檢測卵巢透明細(xì)胞癌、癌旁組織及多種卵巢癌細(xì)胞系中LOX的表達(dá):1.1免疫組化檢測卵巢透明細(xì)胞癌、癌旁組織中LOX的表達(dá):卵巢透明細(xì)胞癌癌旁組織中可以檢測到明顯的LOX表達(dá),而卵巢透明細(xì)胞癌組織中均未檢測到強(qiáng)表達(dá)。LOX陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒,27例卵巢透明細(xì)胞癌癌旁組織中表達(dá)陽性23例(85.2%),表達(dá)陰性為4例(14.8%)。而在卵巢透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)陽性3例(11.1%),表達(dá)陰性為23例(88.9%)。1.2 Western blot法檢測多種卵巢癌細(xì)胞系中LOX的表達(dá):在正常卵巢上皮細(xì)胞中,LOX蛋白呈現(xiàn)較高的表達(dá)水平。在人卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞ES-2,人卵巢上皮細(xì)胞癌細(xì)胞OV-1063,人卵巢腺癌細(xì)胞SKOV3和人卵巢腺癌細(xì)胞OVCAR-3中LOX蛋白表達(dá)水平則明顯降低。2.LOX過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞后細(xì)胞增殖、侵襲能力的變化:轉(zhuǎn)染LOX過表達(dá)質(zhì)粒24小時(24 h)、48小時(48 h)和72小時(72 h)后,ES-2細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制。轉(zhuǎn)染LOX過表達(dá)質(zhì)粒48小時后,ES-2細(xì)胞的侵襲能力受到明顯抑制。差異有統(tǒng)計學(xué)意義,p0.05。3.熒光素酶報告系統(tǒng)及Western blot驗證miR-29b對LOX表達(dá)的調(diào)控:ES-2中miR-29b出現(xiàn)異常高表達(dá),而OV-1063、SKOV3和OVCAR-3中miR-29b 未見有異常表達(dá)。將 Luc-LOX 3' UTR WT 與 Luc-LOX 3' UTR Mut分別轉(zhuǎn)染至ES-2和SKOV3中,miR-29b表達(dá)較高的ES-2細(xì)胞中,Mut組熒光素酶活性較WT組明顯升高;而在miR-29b表達(dá)較低的SKOV3細(xì)胞中,Mut組和WT組熒光素酶活性大致相等。將Luc-LOX 3 ' UTR WT與Luc-LOX 3 ' UTR Mut分別轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞中,再同時過表達(dá)miR-29b,則Luc-LOX 3 ' UTR WT組中過表達(dá)miR-29b能夠有效地降低熒光素酶活性,而Luc-LOX 3' UTR Mut組中則無明顯改變。差異有統(tǒng)計學(xué)意義,p0.05。4.miR-29b過表達(dá)及敲除實驗檢測miR-29b對卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響:轉(zhuǎn)染構(gòu)建miR-29b過表達(dá)和敲低體系。CCK-8法結(jié)果顯示,Mimics組細(xì)胞增殖能力與Scramble組相比并未見明顯變化;而Inhibitor組中ES-2細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制。Transwell法結(jié)果顯示,Mimics組細(xì)胞侵襲能力與Scramble組相比并未見明顯變化;而Inhibitor組中ES-2細(xì)胞的侵襲能力受到明顯抑制。差異有統(tǒng)計學(xué)意義,p0.05。結(jié)論:1.LOX蛋白水平在卵巢透明細(xì)胞癌組織標(biāo)本和多種卵巢癌細(xì)胞系中表達(dá)明顯下調(diào)。2.過表達(dá)LOX能夠抑制卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。3.LOX是miR-29b的靶基因,miR-29b能夠轉(zhuǎn)錄后抑制LOX的蛋白表達(dá)水平。4.敲低內(nèi)源性miR-29b表達(dá)能夠抑制卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和侵襲能力,效應(yīng)與過表達(dá)LOX類似。
[Abstract]:The expression of LOX in different types of tumor cell lines and primary tumors is not identical . The expression of LOX in different types of tumors is not identical . It is suggested that the expression of miR - 29b can be used as a marker for the early diagnosis and development of ovarian cancer . The expression levels of LOX in ovarian clear cell carcinoma cells were detected by Western blot . The expression level of LOX in human ovarian cancer cells was determined by Western blot . The expression level of LOX in ovarian clear cell carcinoma cell line ES - 2 was significantly lower than that in WT group . The expression of miR - 29b in ovarian clear cell carcinoma was significantly lower than that in Scramble group .
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.31

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本文編號：1955903