本文選題：結(jié)腸癌 + 溶瘤腺病毒　； 參考：《首都醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究背景:結(jié)直腸癌(colorectal cancer)是全球第三大常見的惡性腫瘤,占惡性腫瘤致死的第四位[1]。近年來(lái)隨著生活習(xí)慣的改變和人口結(jié)構(gòu)的老齡化,結(jié)腸癌逐漸成為危害我國(guó)居民健康的重大疾病,2015年我國(guó)結(jié)直腸癌新發(fā)病例和死亡病例分別為376300例和19100例,且發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[2]。結(jié)腸癌目前的治療手段包括手術(shù)、放療、化療、靶向治療等,盡管這些治療方法取得了巨大進(jìn)步,但絕大部分病人最終死于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此,探索一種針對(duì)結(jié)腸癌更加有效的治療手段迫在眉睫�；蛑委熌苡行ё饔糜谀[瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。溶瘤腺病毒能在腫瘤細(xì)胞中特異性的復(fù)制并裂解腫瘤細(xì)胞,進(jìn)而釋放的病毒感染鄰近腫瘤細(xì)胞,發(fā)揮級(jí)聯(lián)放大作用。此外,溶瘤腺病毒裂解腫瘤細(xì)胞釋放的腫瘤抗原,可激活局部和全身抗腫瘤免疫,從而達(dá)到治療腫瘤的目的;同時(shí),溶瘤腺病毒能夠介導(dǎo)治療基因在腫瘤局部的高效表達(dá)。Decorin是富含亮氨酸小分子蛋白聚糖(prototypic member of the small leucine-rich proteoglycans,SLRPs)家族成員之一。研究發(fā)現(xiàn),decorin在細(xì)胞粘附、遷移、增殖、凋亡、自噬、分化、炎癥和腫瘤發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。目前已有多項(xiàng)研究證實(shí),decorin在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)。粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF),具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)成熟與分化等作用,已在多項(xiàng)臨床研究中證實(shí)具有顯著的抗腫瘤作用。因此,我們以溶瘤腺病毒為載體,以decorin和GM-CSF為治療基因構(gòu)建溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM,評(píng)價(jià)其體內(nèi)外抗腫瘤作用和免疫激活作用并探索其機(jī)制。目的:將溶瘤腺病毒與治療基因相結(jié)合,構(gòu)建攜帶治療基因decorin和GM-CSF的溶瘤腺病毒,評(píng)價(jià)其體內(nèi)外抗腫瘤作用和免疫激活作用并探索其機(jī)制。材料和方法:首先,收集我院2010年1月至2013年12月共59例結(jié)直腸手術(shù)病人的腫瘤組織、癌旁組織和正常腸組織,根據(jù)病理分析結(jié)果進(jìn)行凍存;收集病人住院資料及隨訪資料;采用real-time RT-PCR和免疫組化檢測(cè)腫瘤組織和相應(yīng)的正常組織中decorin的表達(dá)水平,同時(shí),采用real-time RT-PCR檢測(cè)decorin靶基因Met和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)的表達(dá)水平。其次,采用Adeasy系統(tǒng)構(gòu)建攜帶decorin基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒質(zhì)粒pAd.DCN,并在HEK293細(xì)胞中包裝獲得重組腺病毒Ad.DCN。然后,我們?cè)贖EK293細(xì)胞中大量擴(kuò)增復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad.Null、Ad.DCN,和溶瘤腺病毒rAd.Null、rAd.DCN、rAd.GM和rAd.DCN.GM,然后采用CsCl密度梯度離心純化病毒,采用紫外分光光度法測(cè)定病毒的顆粒滴度和純度。再次,在結(jié)腸癌細(xì)胞中,對(duì)溶瘤腺病毒的體外功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。分別采用溶瘤腺病毒和復(fù)制缺陷型重組腺病毒感染結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、SW620和CT26.WT,然后,采用病毒噬斑擴(kuò)增法測(cè)定病毒在結(jié)腸癌細(xì)胞中的復(fù)制能力;采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中decorin和GM-CSF的表達(dá)水平;采用磺酰羅丹明B(sulforhodamine B,SRB)染色法檢測(cè)溶瘤病毒對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。同時(shí),分離結(jié)直腸癌病人的外周血單個(gè)核細(xì)胞,采用溶瘤腺病毒感染的結(jié)腸癌細(xì)胞制備條件培養(yǎng)液,用條件培養(yǎng)液刺激單個(gè)核細(xì)胞后,檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞因子的表達(dá)水平。最后,采用小鼠CT26.WT細(xì)胞在Balb/c小鼠建立具有完全免疫系統(tǒng)的皮下結(jié)腸癌模型,然后,采用瘤內(nèi)注射溶瘤腺病毒的方式進(jìn)行治療,觀察小鼠的健康狀態(tài)、腫瘤的生長(zhǎng)曲線,通過(guò)病理檢測(cè)腫瘤及各臟器,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫細(xì)胞的表型,通過(guò)real-time PCR檢測(cè)目的基因、decorin靶基因、細(xì)胞因子和化學(xué)趨化因子表達(dá)等,進(jìn)而評(píng)價(jià)溶瘤腺病毒對(duì)結(jié)腸癌的治療作用和機(jī)制。結(jié)果:在結(jié)直腸癌病人腫瘤組織中,decorin蛋白和mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)。其中31例結(jié)腸癌病人的腫瘤組織中,有28例的decorin表達(dá)下調(diào);28例直腸癌病人中,26例表達(dá)下調(diào)。并且,decorin的表達(dá)水平與直腸癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn),decorin表達(dá)下調(diào)可以上調(diào)其主要靶基因Met和VEGFA的表達(dá)水平,可能與腫瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。接下來(lái),我們成功構(gòu)建攜帶decorin(DCN)和GM-CSF(GM)的溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM及其對(duì)照病毒rAd.Null、rAd.DCN、rAd.GM;同時(shí),還成功制備了復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad.Null和Ad.DCN。成功擴(kuò)增和純化得到高質(zhì)量的病毒產(chǎn)品,用于體外和體內(nèi)功能的評(píng)價(jià)。然后,體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM能夠發(fā)揮體外溶瘤功能并介導(dǎo)目的基因的高效表達(dá)。(1)ELISA結(jié)果顯示,rAd.DCN.GM、rAd.DCN和Ad.DCN能夠有效表達(dá)decorin蛋白,而rAd.DCN.GM和rAd.GM可有效表達(dá)目的蛋白GM-CSF;(2)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM在人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480和SW620中復(fù)制能力明顯高于復(fù)制缺陷型腺病毒;而在小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26.WT細(xì)胞中,沒(méi)有檢測(cè)到溶瘤腺病毒明顯的復(fù)制能力;(3)SRB檢測(cè)結(jié)果顯示,溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480、SW620和鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系CT26.WT均能產(chǎn)生顯著的細(xì)胞毒性作用;(4)復(fù)制缺陷型腺病毒Ad.DCN感染SW480的結(jié)果顯示,decorin能顯著下調(diào)重要靶基因c-Met、VEGFA、CNTTB1、TGF-β的mRNA表達(dá)。同時(shí),有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移;(5)溶瘤腺病毒感染SW480的細(xì)胞裂解液,能夠激活人外周血單個(gè)核細(xì)胞中多種細(xì)胞因子的表達(dá)。最后,我們成功建立了具有正常免疫系統(tǒng)的Balb/c小鼠結(jié)腸癌移植瘤模型(CT26.WT皮下移植瘤),在體內(nèi)對(duì)溶瘤腺病毒的抗腫瘤及免疫激活作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。主要結(jié)果包括:(1)溶瘤腺病毒能夠有效抑制結(jié)腸癌移植瘤的生長(zhǎng),而攜帶目的基因的溶瘤腺病毒具有更強(qiáng)的腫瘤抑制作用;(2)病理檢測(cè)結(jié)果顯示,溶瘤腺病毒沒(méi)有顯著的肝臟和脾臟毒性;溶瘤腺病毒能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖,并抑制腫瘤的肺轉(zhuǎn)移,其中,rAd.DCN.GM對(duì)肺轉(zhuǎn)移具有最強(qiáng)的抑制效應(yīng);(3)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM介導(dǎo)目的基因decorin和GM-CSF在腫瘤局部的高效表達(dá),可上調(diào)E-cadherin、下調(diào)VEGFA、N-cadherin和Vimentin的表達(dá);增強(qiáng)化學(xué)趨化因子perforin和granzyme B的表達(dá);(4)溶瘤腺病毒可提升外周血中CD8+T淋巴細(xì)胞的比例;促進(jìn)脾臟中DCs的分化和成熟;抑制脾臟內(nèi)Th2型細(xì)胞因子IL-6、TNF-α和TGF-β的表達(dá);促進(jìn)脾臟INF-γ的表達(dá)。結(jié)論:結(jié)直腸癌病人腫瘤組織中decorin表達(dá)顯著下調(diào),且與腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān);本研究成功制備了攜帶decorin和GM-CSF基因的溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM,rAd.DCN.GM能夠在結(jié)腸癌細(xì)胞中有效復(fù)制并殺傷腫瘤細(xì)胞,同時(shí),高效介導(dǎo)目的基因decorin和GM-CSF的表達(dá);rAd.DCN.GM能夠有效抑制結(jié)腸癌CT26.WT移植瘤的生長(zhǎng),激活抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此,rAd.DCN.GM有望發(fā)展成為治療結(jié)腸癌的基因治療候選藥物。
[Abstract]:Background : Colorectal cancer ( colorectal cancer ) is the third most common malignant tumor in the world . In recent years , with the change of living habits and the aging of population structure , colon cancer has become a major disease which endangers the health of our population . In 2015 , the incidence of new cases and deaths of colorectal cancer in China is 376300 cases and 19100 cases , respectively , and the incidence rate is rising . 緇撹偁鐧岀洰鍓嶇殑娌葷枟鎵嬫鍖呮嫭鎵嬫湳,鏀劇枟,鍖栫枟,闈跺悜娌葷枟絳，

本文編號(hào)：1927212