本文選題：非小細胞肺癌 + MicroRNA-200c��； 參考：《山東大學》2017年博士論文

【摘要】：研究背景肺癌是癌癥相關死亡的主要原因之一,且發(fā)病率有逐年升高的趨勢,其90%的死亡原因與腫瘤轉移影響重要臟器功能有關。越來越多的研究表明腫瘤的侵襲轉移與MicroRNA(miRNA)的表達失調有關。上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是分化的上皮細胞轉化為去分化、具有遷徙能力的間充質樣細胞的過程。一些能夠啟動EMT發(fā)生的信號通路在轉錄和轉錄后水平激活EMT轉錄因子(EMT transcription factor,EMT-TF)并觸發(fā)EMT。EMT-TF包括三個家族:鋅指SNAIL(Snail 1和Snail2/Slug)、鋅指E盒子結合同源框(ZEB1和ZEB2/SIP1)和堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉錄因子(Twist1,Twist2 和 E12/E47)。ZEB2是重要的EMT-TF之一,它通過抑制細胞角蛋白、E-cadherin、巨噬細胞功能相關抗原-1、橋粒蛋白和黏蛋白的轉錄,促進EMT的發(fā)生。miR-200家族能夠與ZEB1/ZEB2 mRNA3'-UTR上的多個位點結合,導致ZEB1/ZEB2 mRNA的破壞,逆轉EMT。作為miR-200家族重要成員之一的miR-200c被廣泛研究,但發(fā)現(xiàn)其表達和功能在不同的腫瘤中表現(xiàn)不同。miR-200c在胃癌、肝癌、腎透明細胞癌等腫瘤中低表達,具有腫瘤抑制劑作用;而在卵巢癌、膀胱癌、子宮內膜癌等腫瘤中高表達,發(fā)揮致癌作用。目前關于miR-200c在非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表達水平、調節(jié)機制及其與NSCLC臨床病理特征之間的相關性也存在爭議。有研究發(fā)現(xiàn)miR-200c在NSCLC組織中上調表達,miR-200c的高表達與NSCLC患者的低生存率相關。也有研究發(fā)現(xiàn)miR-200c在NSCLC腫瘤組織中下調表達,并且其表達水平與腫瘤分期、分化程度、淋巴結轉移、E-cadherin表達情況及病理類型等有關。我們檢測NSCLC組織標本及多種NSCLC細胞株中的miR-200c的表達量,并通過體外實驗驗證miR-200c的生物學功能,以期闡明miR-200c在NSCLC中的表達和功能。目前認為miR-200c通過兩大類途徑調節(jié)EMT:一是通過調節(jié)ZEB1/2/E-cadherin軸抑制EMT發(fā)生,二是通過ZEB1/2以外的靶點抑制EMT發(fā)生。有研究表明miR-200c的表達降低常伴隨ZEB1/2的表達增加,并通過下調E-cadherin促進EMT的發(fā)生。這一調節(jié)通路已在胃癌、胰腺癌、乳腺癌等腫瘤中被證實,但miR-200c在NSCLC中的作用機制有待進一步研究。研究目的探討miR-200c在NSCLC腫瘤組織和細胞株中的表達情況,研究miR-200c對NSCLC細胞遷移、侵襲能力的影響及其靶向ZEB2/E-cadherin軸的調節(jié)機制。為明確miR-200c在NSCLC細胞中的功能奠定理論基礎,為NSCLC的診斷和有效治療方案的研究提供理論依據(jù)。研究方法1.miR-200c與ZEB2在NSCLC組織中的表達及其相關性采用實時定量 PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)檢測 39 對 NSCLC腫瘤組織及其配對的鄰近正常肺組織標本中miR-200c及ZEB2的表達水平。統(tǒng)計分析兩者在NSCLC組織中表達趨勢和相關性,以及miR-200c與年齡、性別、腫瘤病理類型、腫瘤分化程度、腫瘤大小、腫瘤局部分期(T)、淋巴結轉移、遠處轉移、腫瘤TNM分期等臨床病理特征之間的相關性。2.miR-200c在NSCLC細胞株中的表達及對侵襲轉移能力的影響采用qRT-PCR方法檢測NSCLC細胞株A549、H358、H460和H1229中miR-200c的表達水平與正常人肺上皮細胞(BEAS-2B)的差異,選取差異最明顯的一組作為研究對象。將miR-200c類似物、競爭性類似物分別轉染至A549細胞中,qRT-PCR方法檢測轉染后A549細胞miR-200c的表達量,細胞遷移實驗和細胞侵襲實驗觀察各組細胞的增殖、遷移和侵襲情況。3.miR-200c靶向ZEB2抑制NSCLC A549細胞株的侵襲轉移能力雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-200c是否直接結合于非小細胞肺癌A549細胞ZEB2的3'-UTR核心序列;將miR-200c類似物和miR-200c抑制劑轉染至A549細胞,上調和下調miR-200c,測定A549細胞中ZEB2蛋白水平是否隨著miR-200c表達水平的變化而變化;將ZEB2 siRNA轉染至A549細胞,抑制ZEB2的蛋白表達,細胞遷移實驗和細胞侵襲實驗測定細胞增殖、遷移和侵襲能力的變化,觀察該變化是否與上調miR-200c一致。上調或下調miR-200c后,利用Western blot方法檢測A549細胞中EMT標記物N-cadherin、E-cadherin和Vimentin的表達變化,觀察miR-200c對EMT相關蛋白的影響。研究結果1.qRT-PCR方法檢測39對NSCLC腫瘤組織及配對鄰近正常組織標本中miR-200c、ZEB2的表達水平,結果顯示miR-200c在腫瘤組織中下調表達(P0.05),ZEB2在腫瘤組織中上調表達(P0.05),兩者的表達呈負相關(P0.05)。miR-200c表達水平與腫瘤大小、淋巴結轉移數(shù)量、TNM分期負相關(P0.05),與年齡、性別、病理類型、腫瘤分化程度、T分期、遠處轉移無顯著相關。2.qRT-PCR方法檢測BEAS-2B及4種NSCLC細胞株中miR-200c表達水平。結果顯示,BEAS-2B 的 miR-200c 表達量為單位 1,A549、H358、H460 和 H1229細胞株miR-200c相對表達量分別為:0.24、0.51、0.76、0.39,表明miR-200c在各NSCLC細胞株中顯著下調表達(P0.05),在A549細胞株中下調表達最明顯。3.qRT-PCR方法檢測轉染miR-200c類似物對A549細胞株miR-200c表達的影響。結果顯示,正常對照組(Control)miR-200c表達量為單位1,轉染miR-200c類似物組miR-200c相對表達量為7.30,陰性對照組(Negative control,NC)為0.95,證實轉染miR-200c類似物后miR-200c表達顯著增加(P0.05)。細胞遷徙實驗和侵襲實驗驗證上調miR-200c對細胞侵襲轉移能力的影響。設細胞遷徙試驗最初劃痕寬度為單位1,經過48小時培養(yǎng)后,Control、NC、轉染miR-200c類似物組相對劃痕寬度分別為0.66、0.61、0.89,證明轉染miR-200c類似物組細胞增殖、遷徙能力下降(P0.05)。細胞侵襲實驗結果顯示,Control組、NC組、轉染miR-200c類似物組侵襲過膜的A549細胞數(shù)分別為100個/視野、95個/視野、35個/視野,證明轉染miR-200c類似物組細胞遷移、侵襲能力下降(P0.05)。以上實驗證明上調miR-200c能夠抑制A549細胞的遷移侵襲能力。4.制備ZEB2的3'-UTR的野生型和突變型表達質粒pMIR-ZEB2和pMIR-Mut ZEB2。共轉染pMIR-ZEB2和miR-200c類似物的A549細胞中熒光素酶活性為].25;共轉染pMIR-Mut ZEB2和miR-200c類似物組、Control組、NC組的熒光素酶活性均在2.70-2.80之間,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),證實在NSCLC A549細胞中miR-200c核心序列能夠直接與ZEB2 mRNA3'-UTR堿基序列結合,ZEB2是miR-200c的直接靶點。5.qRT-PCR方法檢測轉染miR-200c類似物和抑制劑對A549細胞株miR-200c表達量的影響。結果顯示,Control組miR-200c表達量為單位1,轉染miR-200c類似物組、轉染miR-200c抑制劑組miR-200c相對表達量分別為7.30、0.30,證明轉染miR-200c類似物后miR-200c表達量增加,轉染miR-200c抑制劑miR-200c表達量下降,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Western blot方法測定上調或下調miR-200c后A549細胞中ZEB2蛋白水平。設Control組ZEB2表達量為單位1,則轉染miR-200c類似物組、轉染miR-200c抑制劑組ZEB2相對表達量為0.23、1.6,說明上調miR-200c能顯著抑制ZEB2表達(P0.05),而下調miR-200c能誘導ZEB2蛋白表達顯著增加(P0.05)。證明miR-200c與ZEB2的確存在靶向調節(jié)關系,并且兩者呈負向調節(jié)關系。6.Western blot方法檢測轉染ZEB2 siRNA后的ZEB2表達水平。設Control組ZEB2蛋白表達量為單位1,則NC組、轉染ZEB2 siRNA組ZEB2相對表達量分別為0.95、0.14,證明轉染ZEB2 siRNA導致A549細胞ZEB2蛋白表達水平顯著下降(P0.05)。細胞遷徙實驗和侵襲實驗驗證下調ZEB2對細胞侵襲轉移能力的影響。細胞遷移實驗結果中設Control組、NC組、轉染ZEB2 siRNA組劃痕寬度為單位1,培養(yǎng)48小時后各組相對劃痕寬度分別為0.61、0.63、0.82,相對于兩個對照組,轉染ZEB2 siRNA組A549細胞的增殖和遷徙能力顯著降低(P0.05)。細胞侵襲實驗結果顯示,Control組和NC組過膜細胞數(shù)約為150個/視野,而轉染ZEB2 siRNA組約為40個/視野,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),說明該組細胞遷徙侵襲能力降低。細胞遷移實驗和細胞侵襲實驗均證明下調ZEB2表達抑制了 A549細胞的增殖、遷移和侵襲能力。這與上調miR-200c表達所致結果一致。7.Western blot方法檢測上調或下調miR-200c后EMT標記物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 的表達水平。分別設對照組中 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達量為單位1,則轉染miR-200c類似物組三者的相對表達量分別為2.10、0.28、0.22,三者的前后變化差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),可見過表達miR-200c能夠上調E-cadherin表達,下調N-cadherin和Vimentin表達。與之相反,轉染miR-200c抑制劑組三者的相對表達量分別為0.53、1.56、1.5,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),說明降低miR-200c能夠下調E-cadherin、上調N-cadherin、Vimentin 表達。由此證明 miR-200c 通過 ZEB2/E-cadherin 影響 EMT從而抑制腫瘤侵襲轉移。結論1.miR-200c在NSCLC腫瘤組織中顯著下調表達,ZEB2上調表達,兩者間負相關;miR-200c表達水平與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移數(shù)量、腫瘤大小呈負相關性,與年齡、性別、病理類型、腫瘤分化程度、T分期、遠處轉移無顯著相關。miR-200c有可能成為NSCLC診斷和監(jiān)測疾病進展的生物標記物。2.miR-200c在NSCLC細胞株A549、H358、H460和H1229中顯著下調表達,在A549細胞株中下調表達最明顯。上調miR-200c能夠抑制A549細胞的增殖、遷移和侵襲,進一步驗證了臨床樣本中的研究結果。證實miR-200c具有腫瘤抑制劑的作用,可能成為抑制NSCLC侵襲轉移的治療靶點。3.miR-200c在NSCLC A549細胞中直接靶向ZEB2抑制腫瘤的增殖、遷移和侵襲。miR-200c 的表達變化能夠影響 EMT 標記物:E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表達,證實miR-200c通過ZEB2/E-cadherin軸調控EMT,這有助于深入理解NSCLC侵襲轉移的發(fā)生機制,為研發(fā)新的抗腫瘤藥物提供理論依據(jù)。創(chuàng)新性1.首次證實在NSCLC腫瘤組織標本中,miR-200c下調表達,ZEB2上調表達,兩者的表達負相關。進一步分析發(fā)現(xiàn)miR-200c表達水平與NSCLC腫瘤大小、淋巴結轉移數(shù)量、TNM分期負相關,與年齡、性別、病理類型、腫瘤分化程度、T分期、遠處轉移無顯著相關。2.首次證實miR-200c在NSCLC A549細胞中直接靶向抑制ZEB2,從而影響EMT相關蛋白變化,降低腫瘤的增殖、遷移和侵襲能力。證實在NSCLC中miR-200c和ZEB2之間呈負調節(jié)關系。意義1.本研究證實了 miR-200c在NSCLC腫瘤組織和細胞系中下調表達;miR-200c的表達水平與NSCLC腫瘤大小、淋巴結轉移數(shù)量、TNM分期負相關,推論miR-200c有可能成為NSCLC診斷和監(jiān)測疾病進展的標記物。2.本研究發(fā)現(xiàn)miR-200c表達水平越低,腫瘤越具有侵襲轉移傾向。進一步研究發(fā)現(xiàn),在A549細胞株中上調miR-200c能夠降低腫瘤的侵襲轉移能力,提示miR-200c具有腫瘤抑制劑作用,有可能成為抗腫瘤新藥。3.本研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC腫瘤組織中miR-200c和ZEB2間存在負相關性;在NSCLC A549細胞中進一步證實miR-200c能夠通過ZEB2/E-cadherin軸抑制EMT,降低腫瘤的侵襲轉移能力,這有助于深入理解NSCLC侵襲轉移的發(fā)生機制,為開發(fā)抗腫瘤新藥提供理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

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本文編號：1803626