本文選題：腦梗死 + 骨髓間充質干細胞　； 參考：《南京醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：腦梗死為臨床常見疾病,是由于神經細胞的缺血耐受性和再生能力差,其致殘率和死亡率高,多年來其臨床治療方法法無根本性的進展,給家庭和社會造成了沉重的負擔。干細胞治療近年來發(fā)展迅速,已涉及多種不同領域,為多種難治性疾病,如帕金森、阿爾茲海默癥、糖尿病等帶來了新的希望。近年來隨著干細胞研究和組織工程的發(fā)展,特別是成體干細胞具有自我復制和多向分化潛能的發(fā)現(xiàn),同時其具有取材方便和符合倫理學等特點,使其成為進展最迅速的一個領域。許多動物實驗表明應用干細胞移植治療腦梗死能夠促進神經細胞再生和修復,明顯改善實驗動物的預后,已經開始進行的少量臨床試驗也證實了其可行性和安全性。然而,隨著越來越多的研究證實移植的干細胞到達損傷腦組織的數量很少,存活的時間較短而且長期存活的比例極低,也沒有充分的證據表明干細胞轉化為自體神經細胞及建立神經突觸聯(lián)系。實驗研究發(fā)現(xiàn)在應用干細胞治療心肌、肝及腎臟疾病時,單純移植干細組植干細基同樣有較樣的治療效果,并且避免了細胞移植造成的一些并發(fā)癥,從而提出了旁分泌假說。本研究第一部分,通過分離、培養(yǎng)和鑒定犬骨髓來源成體干細胞,建立穩(wěn)定的犬骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)系,并鑒定它們的干細胞特性。通過缺氧預處理BMSCs與粒細胞集落刺激因子(G-CSF)共培養(yǎng),增強其增殖、遷移及神經分化能力。本研究第二部分,通過慢病毒轉染BMSCs,使其過表達目的基因,并研究其在超順磁氧化鐵納米顆粒(Superparamagnetic Iron Oxide,SPIO)標記后細胞功能及級神經分化能力。在研究的第三部分,通過血栓彈力圖及體外磁共振檢測不同比例血液成分構成血栓,明確不同血栓成分其血栓強度與磁共振信號變化對應關系。在研究的第四部分,通過改良犬自體血栓構建犬腦梗列模型,并由頸內動脈途徑注射基因修飾干細胞并對其進行影像學評估,研究基因修飾后BMSCs對腦梗死的修復作用并探討其可能的作用機制。本研究為BMSCs在神經修復領域積累了實驗研究資料,揭示了其對腦梗死治療的可能性。 、缺氧預處理聯(lián)合粒細胞集落刺激因子對犬骨髓間充質干細胞的作用研究1分離、培養(yǎng)和鑒定犬骨髓間充質干細胞穿刺抽取犬肱骨上段骨髓液,采用密度梯度離心法分離犬骨髓間充質干細胞(BMSCs),通過貼壁法純化培養(yǎng)至P2,流式細胞分析BMSCs不表達CD34,CD45,表達CD44,CD90等間充質干細胞表面抗原。BMSCs具有多向分化潛能,經一定誘導,可在體外向中胚層細胞系,如成骨、成脂胞分化。BMSCs在體外易于擴展培養(yǎng)且可在不同代次冷凍保存,在液氮中冷凍12個月后復蘇,對干細胞增殖能力基本無影響,可繼續(xù)培養(yǎng)或用于進一步研究。2缺氧預處理BMSCs與粒細胞集落測激因子共培養(yǎng)細胞功能與神經分化能力檢測取P3 BMSCs于低氧培養(yǎng)箱,以1%氧濃度作為缺氧處理氧濃度,以6h、12h及24h作為缺氧處理時間,通過CCK-8檢測缺氧處理后細胞增殖能力,Transwell試驗檢測缺氧處理后細胞遷移能力,結果表明缺氧預處理12h組干細胞增殖、遷移能力高于其他組別(P0.05)。其后以12h作為缺氧預處理時間,以常氧組作為對照組,對BMSCs進行體外神經定向誘導分化,結果表明缺氧組神經分化率高于常氧組(68.5%±5.3%v.s.54.3%±7.4%,P0.05),real-time PCR 檢測相關神經 marker MAP-2、NF-L 明顯高于常氧組,細胞遷移能力HH相關細胞因子CXCR-4表達量亦明顯高于常氧組(P0.05)。粒細胞集落刺激因子可進一步促進缺氧預處理后BMSCs的增殖遷移能力。二、基因修飾、SPIO標記犬骨髓間充質干細胞后的神經分化能力檢測1 慢病毒轉染BMSCs構建穩(wěn)定高表達目的基因細胞系采用逐孔稀釋法復核病毒滴度,以不同稀釋倍數稀釋病毒液并轉染P3BMSCs,轉染后通過Guava Express analysis軟件分析綠色熒光表達量,并通過cell counting kit-8(CCK-8)檢測細胞活力,以明確慢病毒對犬BSMCs的親嗜性,并確定最佳復感染指數(multiplicity of infection,MOI值),本研究明確了MOI=10時,BMSCs具有佳綠色熒光蛋白表達率及細胞活力值。通過real-time PCR檢測目的基因BDNF(brain-derived neurotrophic factor)表達含量明顯增高。慢病毒對BMSCs具有較優(yōu)秀的親嗜性,可構建穩(wěn)定的高表達BDNF細胞系。2 BDNF-BMSCs體外SPIO標記及神經誘導分化分別以不同濃度SPIO體外標記犬BMSCs,通過結合標記效率指標普魯士藍染色及臺盼藍檢測細胞毒性,明確SPIO濃度于20μg/mL時,BMSCs具有良好的標記率及低細胞毒性。在一定條件下對BDNF-SPIO-BMSCs進行誘導分化,可見BMSCs細胞形態(tài)上首先出現(xiàn)神經樣改變,兔疫熒光及real-time PRC可檢測神經Marker Nestin,GFAP,TUJ1等表達量明顯高于對照組,同時目的基因亦有明顯高表達。三、不同成分血栓的血栓彈力圖檢測及體外磁共振成像研究1不同成分犬血樣進行血栓彈力圖檢測以穿刺針分別穿刺犬股動靜脈,通過5F鞘抽取動靜脈全血,以4000r/min離心10min,分層后吸取上清層及中間薄膜層。以動脈全血、靜脈全血、動脈上清+薄膜層(動脈上清組)及靜脈血清 +薄膜層(靜脈上清組)分組,分別檢測其血栓彈力圖(TEG),血常規(guī)及病理學HE染色。結果證實:犬全血相比人類相對高凝,上清組血栓形成速率低于全血組,全血組MA值均明顯高于上清組(P0.001),而靜脈上清組MA值高于動脈上清組(P=0.041),表明全血制作血栓其血栓強度可能優(yōu)于上清組,而靜脈上清組制作的血栓其血栓強度可能優(yōu)于動脈上清組。2不同成分犬血制作血栓進行體外影像學及病理學檢測以上述組別血液成分靜置于1.8ml凍存管2h制作血栓分組,以碘油及水作為對照組,置于含明膠溶劑為媒介的塑料器皿中,通過螺旋3T磁共振體外掃描。結果證實上清組血栓信號穩(wěn)定,且T2WI信號值明顯高于全血組,上清組間靜脈組略高于動脈組(364±17,358±20),但無統(tǒng)計學差異(P0.05)。病理學檢測證實,全血組以紅細胞為著,布滿視野,而上清組紅細胞顯著減少,并可見纖維蛋白,與血常規(guī)檢測相符。綜合分析,靜脈上清制作血栓信號穩(wěn)定,血栓強度優(yōu)于動脈組,血栓成分中,隨紅細胞比例增加,T2WI信號值減低。四、動脈內移植基因修飾的骨髓間充質干細胞治療犬腦梗死的研究1.犬大腦中動脈栓塞聯(lián)合頸內動脈近端血流阻斷建立腦梗死模型及其影像學評估采用改良Seldinger技術穿刺右側股動脈置入5F導管鞘。經股動脈鞘引入5F椎動脈導管,超選至頸內動脈上升段約2cm。分別將1.4mm、1.7mm直徑血栓放入裝有對比劑(歐乃派克300)的2ml注射器中將血栓注入導管,并給以間斷性壓力緩慢注射,分別栓塞大腦中動脈遠端及M1段的近端,完成相對大面積腦梗死建模。腦梗建模后6小時進行T2WI,可初次在栓塞大腦中動脈供血區(qū)域見到異常高信號,隨時間進展,腦梗病灶范圍變小,界限變清晰(圖5)。建模24小時后,校正后平均腦梗死體積為4173.23± 603.92mm3。模型建立后7天平局腦梗死為3273.21 ± 616.05 mm3,其體積較建模24小時校正后腦梗體積明顯減小(P0.01)。2 SPIO-BMSCs經動脈途徑移植影像學示蹤研究以20μg/mLSPIO進行犬BMSCs、BDNF-BMSCs標記后,經犬頸內動脈注射1×106數量級干細胞,通過磁共振對比分析兩組干細胞在移植前、移植后不同時間點(1小時、24小時、1周、2周、3周、4周)在梗死灶示蹤狀況。結果示標記細胞在3.0TMRIT2*WI和SWI序列上信號減低最明顯。隨標記后培養(yǎng)時間延長,SPIO標記率及信號強度均下降,體外MRI僅可示蹤到4周左右,兩組間無明顯差異。3經動脈途徑移植基因修飾干細胞治療犬腦梗死建模1周后將18只比格犬隨機分為3組:BDNF+組(A組),BDNF-組(B組)及空白對照組(C組),各組腦梗體積分別為:3166.10±487.77、3292.05±518.62、3204.80±359.37,組間腦梗體積無統(tǒng)計學差異(P0.05)。隨時間推移不同組別腦梗體積呈現(xiàn)不同程度下降,移植組(A、B組)于移植后第二周腦梗體積明顯低于未移植組,表明細胞移植組療效優(yōu)于未移植組(C組),第四周A組梗死體積明顯低于B組,表明BDNF+BMSCs療效優(yōu)于BDNF-組,即單純BMSCs組。建模1周后各組犬神經系統(tǒng)評分分別為:4.50±0.75、4.37±1.18、4.87±0.64,組間腦梗體積無統(tǒng)計學差異(P0.05)。隨時間推移不同組別犬神經系統(tǒng)評分呈現(xiàn)不同程度下降,細胞移植后第一周起,移植組(A、B組)犬神經功能評分顯著低于未移植組(C組),P=0.004;多重比較顯示A、B組組間無統(tǒng)計學差異,P0.05。細胞移植后第二周起,A組犬神經功能評分明顯低于B組(2.37±0.51,2.87±0.35,P=0.037);至移植后第四周,犬神經功能評分分別為1.62±0.51、2.12±0.35、2.75±0.46(P0.001)。結論本研究成功分離、培養(yǎng)了犬骨髓間充質干細胞(BMSCs),明確了缺氧處理可增強BMSCs的體外增殖、遷移能力以及神經分化潛能,說明了 BMSCs比較適于適應缺氧環(huán)境,同時其神經分化潛能的增強更有力的證明了其在體內缺氧環(huán)境(腦梗死灶)發(fā)揮替代作用的可能性。經過慢病毒轉染與SPIO標記,BMSCs成功過表達目的基因BDNF,其神經分化能力進一步提高。以犬改良自體血栓構建腦梗死為基礎,證實BDNF-BMSCs的移植可進一步減低梗死面積,改善腦梗預后。
[Abstract]:In the third part of the study , we found that the transplantation of stem cells to treat cerebral infarction can promote the regeneration and repair of neural cells , improve the prognosis of experimental animals . ,緙烘哀棰勫鐞嗚仈鍚堢矑緇嗚優(yōu)闆嗚惤鍒烘縺鍥犲瓙瀵圭姮楠ㄩ珦闂村厖璐ㄥ共緇嗚優(yōu)鐨勪綔鐢ㄧ爺絀，

本文編號：1792954