本文關鍵詞：SIRT1調(diào)控自噬對人椎間盤髓核細胞退變的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《重慶醫(yī)科大學》 2015年

SIRT1調(diào)控自噬對人椎間盤髓核細胞退變的影響

江維  

【摘要】：第一部分人椎間盤髓核組織分離、鑒定及髓核細胞培養(yǎng)目的：掌握人椎間盤髓核細胞的分離、培養(yǎng)方法,為后續(xù)實驗打下基礎。方法：采用Collagen Ⅱ免疫組化、透射電鏡觀察鑒定從青壯年腰椎爆裂骨折及中老年脊柱退行性疾病手術中取得的椎間盤標本經(jīng)分離后的髓核組織；應用0.25%胰酶、2%Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化從中老年椎間盤突出癥／腰椎滑脫癥手術中取得的椎間盤經(jīng)分離后的髓核組織進行細胞培養(yǎng),光鏡觀察、Collagen Ⅱ免疫細胞化學鑒定髓核細胞。結(jié)果：Collagen Ⅱ免疫組化、透射電鏡觀察證實從青壯年腰椎爆裂骨折及中老年脊柱退行性疾病手術中取得的椎間盤標本經(jīng)分離后的部分為髓核組織；成功培養(yǎng)出人退變椎間盤髓核細胞,形態(tài)學觀察及Collagen Ⅱ免疫細胞化學鑒定證實培養(yǎng)的為髓核細胞。結(jié)論：成功分離鑒定人椎間盤髓核組織；0.25%胰酶、2%Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化法成功培養(yǎng)出原代人椎間盤退變髓核細胞,并行傳代培養(yǎng),光鏡下形態(tài)學觀察、Collagen Ⅱ免疫細胞化學鑒定證實培養(yǎng)細胞為髓核細胞。第二部分自噬活性在人正常椎間盤髓核細胞及退變髓核細胞中的表達及意義目的：明確人正常椎間盤髓核細胞及退變髓核細胞中自噬活性的差異,SIRT1表達差異以及不同髓核細胞凋亡情況。方法：電鏡觀察不同髓核細胞中自噬體的數(shù)量；熒光定量PCR Western Blot方法檢測不同髓核標本中SIRT1、LC3、Beclin-1的基因及蛋白表達差異；免疫組化檢測不同髓核標本中SIRT1、Collagen Ⅱ、 Caspase3的蛋白表達差異；TUNEL法檢測不同髓核標本中凋亡率差異。結(jié)果：退變髓核細胞中自噬體數(shù)量,SIRT1、LC3、Beclin-1的基因表達,SIRT1、LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Collagen Ⅱ的蛋白表達均較正常髓核細胞明顯降低(P0.05)；退變髓核細胞Caspase3蛋白表達及凋亡率較正常髓核細胞明顯升高(P0.05)。結(jié)論：本實驗證實人退變髓核細胞中SIRT1低表達、自噬活性降低、細胞凋亡率增高；SIRT1與髓核細胞自噬活性呈正向關系,與細胞凋亡呈反向關系,髓核細胞自噬活性與凋亡呈反向關系。第三部分SIRT1調(diào)控自噬對人退變髓核細胞凋亡的影響及分子機制研究目的：探討SIRT1是否能夠通過調(diào)節(jié)人退變髓核細胞的自噬從而調(diào)控髓核細胞凋亡及可能的分子機制。方法：首先用SIRT1激動劑resveratrol、抑制劑nicotinamide、 SIRT1-siRNA處理退變髓核細胞后用Western Blot法檢測SIRT1、LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1的表達,用流式細胞儀檢測凋亡率變化。然后resveratrol處理髓核細胞后用自噬抑制劑bafilomycin A抑制自噬,Western Blot法檢測LC3 Ⅱ/Ⅱ、cleaved caspase3的表達,用流式細胞儀檢測凋亡率變化。最后分別用P13K抑制劑LY294002和MEK抑制劑PD98059處理髓核細胞后,Western Blot法檢測Akt及Erkl/2信號通路相關蛋白激活表達情況。結(jié)果：SIRT1激動劑resveratrol處理細胞后能提高LC3 Ⅱ/Ⅰ、 Beclin-1的表達,同時降低髓核細胞凋亡率(P0.05)。SIRT1抑制劑nicotinamide、SIRT1-siRNA處理退變髓核細胞后降低LC3 Ⅱ/Ⅰ、 Beclin-1的表達,同時髓核細胞凋亡率增加(P0.05)。bafilomycin A能夠提高LC3 Ⅱ/Ⅰ表達(P0.05),使凋亡率增加(P0.05),同時能抵消resveratrol降低髓核細胞凋亡率的作用。Western Blot結(jié)果顯示LY294002能夠通過抑制Akt磷酸化從而抑制LC3 Ⅱ/Ⅰ表達(P0.05),但resveratrol能部分抵消LY294002對LC3 Ⅱ/Ⅰ表達的抑制作用；PD98059能夠通過抑制Erk1/2的磷酸化部分降低LC3 Ⅱ/Ⅰ表達,而resveratrol不能逆轉(zhuǎn)PD98059抑制LC3 Ⅱ/Ⅰ表達的作用。結(jié)論：SIRT1通過促進自噬抑制退變髓核細胞的凋亡,SIRT1通過磷酸化Erk1/2信號發(fā)揮調(diào)節(jié)人退變髓核細胞自噬的功能。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R681.5
【目錄】：

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