本文選題：氧化吡啶巰基鎳 + 凋亡��； 參考：《廣州醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：獲得性伊馬替尼耐藥以慢性粒細(xì)胞白血病患者細(xì)胞內(nèi)Bcr-Abl突變作為特征,這種突變抑制了伊馬替尼與酪氨酸激酶結(jié)合。Bcr-Abl T315I位點(diǎn)突變是獲得性伊馬替尼耐藥的主要機(jī)制。因此,尋找克服伊馬替尼耐藥的治療方法和靶向策略是目前急需的。我們最近已經(jīng)報(bào)道,氧化吡啶巰基鎳(Nickel pyrithione,NiPT)能夠通過19S蛋白酶體相關(guān)的去泛素化酶(USP14和UCHL5)靶向抑制作用,抑制泛素蛋白酶體系統(tǒng),但這并不影響20S蛋白酶體功能。因此,接下來,我們將進(jìn)一步探討:(1)NiPT不僅能夠誘導(dǎo)伊馬替尼敏感型和伊馬替尼耐藥型細(xì)胞產(chǎn)生凋亡,還能夠抑制裸鼠移植瘤生長;(2)NiPT通過下調(diào)Bcr-Abl mRNA水平及蛋白酶體抑制作用誘導(dǎo)caspase激活,從而下調(diào)Bcr-Abl表達(dá);(3)19S蛋白酶體相關(guān)去泛素化酶抑制作用介導(dǎo)caspase激活和細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明,NiPT通過Bcr-Abl依賴與非依賴機(jī)制,克服伊馬替尼耐藥,為慢性粒細(xì)胞白血病的治療提供了重大的臨床意義。為此,本課題以氧化吡啶巰基鎳(Nickel Pyrithione,NiPT)在慢性粒細(xì)胞白血病伊馬替尼敏感型和伊馬替尼耐藥型細(xì)胞中的作用展開了具體的探討,進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):1、NiPT降低IM-敏感型和IM-T315I突變型細(xì)胞活力分別在以下細(xì)胞中使用不同濃度的NiPT作用48小時(shí):伊馬替尼敏感型細(xì)胞系KBM5、BaF3-p210-WT,伊馬替尼耐藥型Bcr-Abl-T315I突變型細(xì)胞系KBM5R和BaF3-p210-T315I細(xì)胞,及Bcr-Abl野生型細(xì)胞系K562細(xì)胞。所有慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞活力均有明顯的劑量依賴性降低,50%抑制濃度(IC50)在KBM5、KBM5R、BaF3-p210-WT、BaF3-p210-T315I及K562細(xì)胞中分別是0.14,0.17,0.3,0.16和0.98μM。用臺盼藍(lán)染色法進(jìn)一步檢測NiPT對慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的活力效應(yīng)。所有的細(xì)胞系的細(xì)胞活性均呈時(shí)間和劑量依賴性的抑制,這反映了NiPT在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中的抗腫瘤活性。2、NiPT誘導(dǎo)IM-敏感型和IM-T315I突變型細(xì)胞凋亡我們評估NiPT誘導(dǎo)IM-敏感型和IM-T315I突變型細(xì)胞死亡的能力。不同濃度的NiPT處理KBM5、KBM5R、K562、BaF3-p210-WT及Ba F3-p210-T315I細(xì)胞后,通過在倒置熒光顯微鏡記錄Annexin V/PI雙陽性細(xì)胞數(shù),我們觀察到細(xì)胞時(shí)間依賴性死亡的比例不斷增加。這些結(jié)果均支持NiPT誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡這一結(jié)論。3、NiPT誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與caspase激活及抗凋亡蛋白表達(dá)下調(diào)相關(guān)為了探索NiPT誘導(dǎo)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡的機(jī)制,不同時(shí)間及濃度的NiPT處理IM-敏感型和IM-T315I突變型細(xì)胞后,我們對凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。NiPT能夠顯著地增加細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白PARP的切割。同時(shí),數(shù)據(jù)表明NiPT劑量和時(shí)間依賴性地激活了caspase 3、caspase 8和caspase 9級聯(lián)反應(yīng)。線粒體是細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)中樞,這是一個(gè)被廣泛接受的概念。因此我們接下來研究NiPT是否影響細(xì)胞線粒體膜的完整性。研究結(jié)果表明,用NiPT處理所有慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞后,其線粒體膜的完整性均有下降。細(xì)胞色素C(Cytochrome C)和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)從線粒體內(nèi)釋放到細(xì)胞質(zhì)中,這一過程被公認(rèn)為凋亡的早期標(biāo)志。因此我們認(rèn)為NiPT觸發(fā)了線粒體途徑,且Cyto C和AIF的釋放增加發(fā)生于較早的時(shí)間點(diǎn),這表明NiPT激活了慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的線粒體凋亡通路。為了進(jìn)一步探討NiPT誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制,我們還檢測了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果表明,抗凋亡蛋白Mcl-1,XIAP,Bcl-2和Survivin的表達(dá)明顯下降。4、NiPT誘導(dǎo)的蛋白酶體抑制與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞凋亡相關(guān)可以確定的是,去泛素化酶或蛋白酶體的抑制作用均導(dǎo)致泛素化蛋白質(zhì)的聚集。與我們先前在其他癌癥細(xì)胞中曾報(bào)道的類似,在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中,NiPT劑量和時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)泛素化蛋白質(zhì)(Ubs)和蛋白酶體底物蛋白p27的積累,這種現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)在PARP切割之前。特別地是,Ni PT并不改變KBM5、KBM5R細(xì)胞的20S蛋白酶體活性。蛋白酶體抑制劑,硼替佐米,作為20S蛋白酶體抑制劑的陽性對照。根據(jù)我們之前的報(bào)道,NiPT可以以19S蛋白酶體相關(guān)的去泛素化酶作為靶點(diǎn),有效地抑制泛素蛋白酶體系統(tǒng)。在KBM5R細(xì)胞裂解液中,NiPT能夠與HA-UbVS競爭性結(jié)合USP14和UCHL5位點(diǎn)。此外,USP14的磷酸化水平也有大幅減少,這也表明了NiPT對USP14的去泛素化酶活性抑制作用。泛素化蛋白質(zhì)的聚集會導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)和細(xì)胞凋亡。NiPT誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER-stress)實(shí)驗(yàn)表明,在KBM5和KBM5R細(xì)胞中,NiPT激活了PERK相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路,p-eIF2a表達(dá)水平的升高是最好證明。這些結(jié)果均表明,NiPT在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中介導(dǎo)的蛋白酶體抑制在其所誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和caspase激活中起了重要作用。5、NiPT下調(diào)Bcr-Abl蛋白表達(dá)水平,并抑制其下游信號通路我們發(fā)現(xiàn),NiPT能夠劑量和時(shí)間依賴性地下調(diào)IM-敏感型和IM-T315I突變型細(xì)胞中總的和磷酸化的Bcr-Abl蛋白水平。進(jìn)一步研究顯示NiPT影響了Bcr-Abl下游靶蛋白的表達(dá)水平。STAT5,Akt和Crkl的磷酸化水平也呈劑量和時(shí)間依賴性降低,這發(fā)生于其總體蛋白水平下調(diào)之前。6、Bcr-Abl基因表達(dá)水平減少及caspase切割導(dǎo)致Bcr-Abl蛋白水平下調(diào)為了探討NiPT在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中所介導(dǎo)的Bcr-Abl表達(dá)水平下調(diào)的機(jī)制,我們分析了Bcr-Abl融合基因的轉(zhuǎn)錄水平。使用不同濃度的NiPT處理KBM5、KBM5R細(xì)胞6小時(shí),RT-PCR結(jié)果顯示Bcr-Abl的mRNA水平在一定程度上有所下降。雖然Bcr-Abl的mRNA水平降低程度明顯低于相應(yīng)蛋白水平的降低,但NiPT所致Bcr-Abl mRNA表達(dá)水平下調(diào)可能有助于對Bcr-Abl蛋白的減少。為了進(jìn)一步研究這個(gè)問題,我們對RNA聚合酶II(RNA pol II)進(jìn)行了分析。RNA聚合酶II的磷酸化水平在一定程度上是減少的。NiPT抑制RNA聚合酶的表達(dá),從而下調(diào)包括Bcr-Abl突變型細(xì)胞的Bcr-Abl mRNA水平和蛋白水平。有報(bào)道稱,Bcr-Abl可以被caspase切割。為了進(jìn)一步探討NiPT下調(diào)Bcr-Abl表達(dá)的機(jī)制,我們對Bcr-Abl與caspase活化之間的聯(lián)系進(jìn)行了研究。我們觀察到,泛-caspase抑制劑ZVAD能夠大部分逆轉(zhuǎn)NiPT介導(dǎo)的細(xì)胞死亡及Bcr-Abl的下調(diào),卻不能夠反轉(zhuǎn)泛素化蛋白質(zhì)的聚集。這表明,NiPT通過抑制蛋白酶體活性,激活caspase級聯(lián)反應(yīng),從而下調(diào)Bcr-Abl及其下游通路的表達(dá)。7、NiPT在慢性粒細(xì)胞白血病原發(fā)性單核細(xì)胞中的體外活性研究接下來,我們進(jìn)一步研究NiPT在12例慢性粒細(xì)胞白血病病人骨髓標(biāo)本中的抗腫瘤作用(其中4例為IM-耐藥病人)。結(jié)果顯示,NiPT抑制病人原發(fā)性單核細(xì)胞活力,其IC50值在0.58μM到0.82μM之間。NiPT處理36小時(shí)后,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示NiPT劑量依賴性誘導(dǎo)病人原發(fā)性單核細(xì)胞凋亡。同時(shí),NiPT還能夠顯著地增加病人細(xì)胞中泛素化蛋白質(zhì)及蛋白底物IκB-α聚集,激活caspase-3和caspase-9,減少PARP切割。這些結(jié)果表明,NiPT對病人原發(fā)性單核細(xì)胞的抑制作用與體外細(xì)胞系作用相一致,提示NiPT對慢性粒細(xì)胞白血病病人的潛在治療作用。8、NiPT抑制IM-敏感型和IM-耐藥型裸鼠移植瘤生長接下來,我們檢測NiPT在裸鼠移植瘤中的應(yīng)用。皮下接種KBM5和KBM5R細(xì)胞于裸鼠體內(nèi)。與正常對照組相比,NiPT處理組中腫瘤的生長顯著下降。且裸鼠體重相對穩(wěn)定。藥物處理組中Bcr-Abl及其下游靶點(diǎn)Akt、STAT5的表達(dá)均有明顯地下調(diào);泛素化蛋白質(zhì)和泛素化蛋白底物P27明顯聚集,提示NiPT能夠同時(shí)抑制IM敏感型和IM耐藥型細(xì)胞移植瘤的生長。同時(shí),對增殖、分化、粘附相關(guān)標(biāo)志蛋白,Ki67、CD11b/c和CXCR4的檢測發(fā)現(xiàn),NiPT能下調(diào)其蛋白表達(dá)。這些結(jié)果表明,NiPT能夠有效抑制IM敏感型和IM耐藥型裸鼠移植瘤生長。結(jié)論:NiPT通過下調(diào)Bcr-Abl轉(zhuǎn)錄水平和蛋白酶體抑制介導(dǎo)的caspase激活切割Bcr-Abl從而減少Bcr-Abl野生型和Bcr-Abl-T315I突變型細(xì)胞中Bcr-Abl的表達(dá)。同時(shí),19S蛋白酶體相關(guān)去泛素化酶抑制作用在NiPT誘導(dǎo)的caspase激活和細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用。我們在這里提出了一種通過下調(diào)Bcr-Abl表達(dá)從而克服伊馬替尼耐藥的非傳統(tǒng)治療方案,為慢性粒細(xì)胞白血病克服伊馬替尼耐藥的治療提供重大的臨床意義。此部分研究內(nèi)容已經(jīng)在《J Hematology Oncology》上發(fā)表,可以為今后NiPT的臨床試驗(yàn)以及臨床應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R733.7

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本文編號：1766599