發(fā)布時間：2018-04-15 07:44

  本文選題：外泌體 + 間充質(zhì)干細胞��； 參考：《天津醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：目的:觀察人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,h UCMSCs)外泌體對藍光損傷后人視網(wǎng)膜色素上皮(retina pigment epithelial,RPE)細胞及多波長激光誘導大鼠脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)A表達的影響。方法:1.h UCMSCs外泌體的提取與鑒定。培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞,收集上清液,采取梯度超速離心法分離純化外泌體,透射電鏡觀察外泌體形態(tài),蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測外泌體表面特異性標志蛋白CD63及h UCMSCs表面蛋白CD90表達。2.h UCMSCs外泌體對藍光損傷后人RPE細胞VEGF-A表達的影響。取生長良好的人RPE細胞(ARPE-19),隨機分為正常對照組,光損傷組和不同濃度及時間h UCMSCs外泌體處理組。運用藍光(2000士500)lx照射ARPE-19細胞12h,建立光損傷模型,分別以25μg/ml,50μg/ml,75μg/ml的h UCMSCs外泌體處理藍光損傷的RPE細胞8h,16h,24h。Western Blot及免疫熒光檢測RPE細胞VEGF-A蛋白的表達,實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測RPE細胞VEGF-A m RNA的表達。3.h UCMSCs外泌體對多波長激光誘導大鼠CNV模型VEGF-A表達的影響。健康雄性灰色挪威(brown Norway,BN)大鼠90只隨機分為正常對照組,模型組,不同濃度h UCMSCs外泌體處理組及生理鹽水對照組,每組各15只。除正常對照組外各實驗組以多波長氪紅激光進行眼內(nèi)光凝,圍繞視盤光凝8個激光點,參數(shù)設(shè)置:波長:577nm,能量:200mw,光斑直徑:100μm,曝光時間:0.1s。按照組別分別以1μl、2μl、3μl h UCMSCs外泌體及2μl生理鹽水行玻璃體腔注射。飼養(yǎng)大鼠14,21天行眼底熒光血管造影(fundus fluorescein angiography,FFA)檢測,各組間比較激光點滲漏情況.蘇木素-伊紅染色觀察各組大鼠CNV組織學結(jié)構(gòu),免疫組織化學染色法觀察各組別VEGF-A蛋白表達。結(jié)果:1.超速離心法成功提取h UCMSCs外泌體,電鏡下顯示外泌體為類圓形囊泡結(jié)構(gòu),直徑為50-100nm,Western Blot檢測h UCMSCs外泌體表面特異性蛋白CD63陽性。2.細胞學實驗:光損傷組與正常對照組比較,VEGF-A蛋白及m RNA表達均顯著提高(P0.05)。不同濃度h UCMSCs外泌體處理藍光損傷的RPE細胞不同時間后,VEGF-A蛋白及m RNA表達均有下降,與損傷組對比有統(tǒng)計學差異(P0.05)。并且,隨著h UCMSCs外泌體作用濃度及作用時間增強,光損傷RPE細胞VEGF-A蛋白及m RNA下調(diào)作用越強,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。免疫熒光顯示,相同作用時間隨著h UCMSCs外泌體作用濃度提高,VEGF-A蛋白表達不斷下降。3.動物學實驗:不同劑量h UCMSCs外泌體處理激光誘導大鼠CNV模型,激光點滲漏明顯減輕,與激光誘導組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);且隨注射劑量增加,改善滲漏效果越顯著,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。免疫組化染色顯示,不同劑量h UCMSCs外泌體處理組VEGF-A蛋白表達下降,與激光誘導組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);且隨注射劑量增加,VEGF-A蛋白表達下降越顯著,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。HE染色顯示隨著h UCMSCs外泌體劑量增高,大鼠CNV結(jié)構(gòu)改變逐漸減輕。結(jié)論:1.h UCMSCs上清液中利用梯度超速離心法能夠提取出穩(wěn)定劑量外泌體,經(jīng)過表面特異性抗原檢測,能證實其來源可靠。2.h UCMSCs外泌體能夠有效降低藍光誘導的人RPE細胞的VEGF-A表達,并與作用濃度和作用時間呈正相關(guān)。3.h UCMSCs外泌體能有有效改善激光誘導大鼠脈絡(luò)膜新生血管模型滲漏及VEGF-A蛋白表達,且與藥物劑量呈正相關(guān)。
[Abstract]:鐩殑:瑙傚療浜鴻剱甯﹂棿鍏呰川騫茬粏鑳，

本文編號：1753195