發(fā)布時間：2018-04-15 01:12

  本文選題：人源化小鼠 + 重組人生長激素��； 參考：《吉林大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究目的:種屬間的差異導(dǎo)致通過傳統(tǒng)動物模型無法準(zhǔn)確預(yù)測人類生理、病理情況并有效評價藥物臨床效果。在免疫缺陷小鼠上共移植人胚胎胸腺和人胎肝造血干細(xì)胞建立的具有人免疫系統(tǒng)的人源化小鼠模型被國際公認(rèn)為當(dāng)前整體研究人類免疫學(xué)問題以及相關(guān)疾病的最有效工具之一。然而,由于小鼠分泌的某些造血免疫發(fā)育相關(guān)因子和人細(xì)胞無反應(yīng)或反應(yīng)弱,人源化小鼠中的人免疫系統(tǒng)組成和功能還不完善,需要進(jìn)一步優(yōu)化。作為神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要一員,生長激素(growth hormone,GH)已被體外實驗與小鼠體內(nèi)實驗證明同胸腺發(fā)育、骨髓中淋巴造血細(xì)胞分化都有密切聯(lián)系。有研究表明,小鼠生長激素(mouse growth hormone,mGH)與人體細(xì)胞的生長激素受體(growth hormone receptor,GHR)激活無交叉反應(yīng),這可能成為限制人源化小鼠中人免疫系統(tǒng)的重建和功能的潛在因素。因此,研究人生長激素對人源化小鼠中人造血免疫系統(tǒng)的影響及其作用機(jī)制,并據(jù)此優(yōu)化人源化小鼠模型的構(gòu)建方案具有重要意義。本研究以期通過重組人生長激素(recombinant huamn growth hormone,rhGH)優(yōu)化人源化小鼠人免疫系統(tǒng)的重建。同時,借助人源化小鼠模型,探究rhGH對人胚胎造血干細(xì)胞(human hematopoietic stem cell,hHSC)及各造血免疫細(xì)胞亞群體內(nèi)增殖分化的影響。研究方法:(1)體外建立造血干細(xì)胞擴(kuò)增體系,利用BrdU試劑盒檢測并比較不同濃度rhGH單獨或聯(lián)合造血干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF)時對造血干細(xì)胞擴(kuò)增效率的影響。(2)構(gòu)建人源化小鼠模型:通過免疫磁珠分選方法分選出人胚胎肝臟內(nèi)的CD34+造血干細(xì)胞并檢測純度。亞致死劑量照射免疫缺陷小鼠——NCG小鼠,進(jìn)一步清除小鼠的造血免疫組織。將造血干細(xì)胞以尾靜脈注射方式移植到NCG小鼠體內(nèi)。(3)在人源化小鼠構(gòu)建第3周、6周、9周時檢測人源化小鼠體內(nèi)的人造血免疫細(xì)胞水平。主要檢測人白細(xì)胞(whitebloodcell,wbc)、髓系細(xì)胞、t淋巴細(xì)胞、b淋巴細(xì)胞、nk細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、紅細(xì)胞占外周血總細(xì)胞及人免疫細(xì)胞比例。在人源化小鼠重建10周后處死小鼠,檢測小鼠外周血(peripheralblood,pb)、脾臟、骨髓(bonemarrow,bm)中上述細(xì)胞比例。同時,檢測小鼠外周血、脾臟、骨髓、胸腺中t淋巴細(xì)胞及其亞群比例:檢測輔助性t細(xì)胞(thelpcells,th)、細(xì)胞毒性t細(xì)胞(cytotoxictcells,tc)比例;靜息t細(xì)胞、效應(yīng)t細(xì)胞;中樞記憶性t細(xì)胞(centralmemorytcells,tcm)、效應(yīng)記憶性t細(xì)胞(effectormemorytcells,tem)、終末分化t細(xì)胞(terminaldifferentiationaltcells,ttd)比例;及胸腺新產(chǎn)生的輔助性t細(xì)胞比例;檢測小鼠外周血、脾臟及骨髓中分化發(fā)育各階段b淋巴細(xì)胞比例:b細(xì)胞祖細(xì)胞(pro-b)、b細(xì)胞前體細(xì)胞(pre-b)、未成熟b細(xì)胞(immature-b)、成熟b細(xì)胞(mature-b)比例;檢測骨髓中紅細(xì)胞及其發(fā)育各階段的亞群比例:較幼稚的大紅細(xì)胞、較成熟的小紅細(xì)胞;及根據(jù)cd71和cd235a表面標(biāo)志物區(qū)分的原紅細(xì)胞、中幼紅細(xì)胞、晚幼紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞紅細(xì)胞比例。(4)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測經(jīng)rhgh體外擴(kuò)增的hhsc以及人源化小鼠骨髓內(nèi)重建的hhsc中,具有持續(xù)多潛能性的hhsc比例變化。(5)利用連續(xù)移植hhsc構(gòu)建人源化小鼠的方法驗證rhgh對造血干細(xì)胞持續(xù)多潛能性的影響。通過將人源化小鼠骨髓內(nèi)重建的cd34+的hhscs作為移植物,移植到另一批免疫缺陷小鼠體內(nèi),構(gòu)建人源化小鼠二次移植模型。評價rhgh處理對hhsc在人源化小鼠體內(nèi)二次重建人免疫造血系統(tǒng)能力的影響。研究結(jié)果:(1)體外造血干細(xì)胞擴(kuò)增中,rhgh組造血干細(xì)胞的擴(kuò)增效率明顯弱于scf組。不同濃度的rhgh對造血干細(xì)胞的作用結(jié)果不同,低濃度(10ng/ml)組可促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖,中等濃度及高濃度rhgh未表現(xiàn)出促增殖作用,亦不表現(xiàn)抑制作用。低濃度rhgh協(xié)同scf可進(jìn)一步提高造血干細(xì)胞的增殖效率。(2)在構(gòu)建人源化小鼠后,rhgh組小鼠狀態(tài)恢復(fù)更快,骨髓he染色發(fā)現(xiàn)rhgh組造血組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)較快。在構(gòu)建后第3周、第6周、第9周檢測到rhgh組外周血中表達(dá)cd45的白細(xì)胞比例明顯增加,約為對照組的2倍。各免疫細(xì)胞亞群細(xì)胞數(shù)增加,且在人白細(xì)胞中比例與PBS組無明顯差異。在構(gòu)建第10周檢測脾臟及骨髓中結(jié)果與外周血中趨勢一致。(3)構(gòu)建人源化小鼠第10周檢測小鼠脾臟、外周血、胸腺及骨髓中T細(xì)胞及其各亞群比例,rhGH組胸腺新產(chǎn)生的輔助性少于對照組,其余T細(xì)胞亞群比例與PBS組均無差別。(4)構(gòu)建人源化小鼠第10周檢測小鼠脾臟、外周血及骨髓中B細(xì)胞及其發(fā)育各階段細(xì)胞亞群的比例,rhGH組人B細(xì)胞重建水平更高。骨髓中Pro-B細(xì)胞比例高于對照組,其余分化各階段細(xì)胞無明顯差異。外周血及脾臟中,rh GH提高了Pro-B細(xì)胞和Pre-B細(xì)胞在較幼稚的細(xì)胞的比例。(5)構(gòu)建人源化小鼠第10周時檢測骨髓中人紅細(xì)胞及其發(fā)育各階段細(xì)胞亞群比例:rhGH組骨髓中人紅細(xì)胞重建水平更高,較幼稚的大紅細(xì)胞比例增加,且原紅細(xì)胞、中幼紅細(xì)胞和晚幼紅細(xì)胞比例均高于對照組,而網(wǎng)織紅細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞比例在兩組間無差異。外周血中未檢測到人紅細(xì)胞。(6)rhGH體外促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖時,其中具有持續(xù)多潛能性的hHSC比例與對照組相比未發(fā)生變化,人源化小鼠骨髓內(nèi)造血干細(xì)胞持續(xù)多潛能性檢測得到相似結(jié)果。二次移植hHSC的人源化小鼠人免疫系統(tǒng)重建在兩組均可實現(xiàn)。研究結(jié)論:rhGH可促進(jìn)人胚胎造血干細(xì)胞增殖及人源化小鼠體內(nèi)造血免疫系統(tǒng)的重建,并且不影響人胚胎造血干細(xì)胞的持續(xù)多潛能性,最終優(yōu)化人源化小鼠模型:(1)rhGH可促進(jìn)人源化小鼠骨髓、脾臟及外周血中人白細(xì)胞(主要為B淋巴細(xì)胞)重建水平,尤其增加較幼稚的B細(xì)胞祖細(xì)胞和B細(xì)胞前體細(xì)胞的比例。(2)rhGH可促進(jìn)人源化小鼠骨髓內(nèi)人紅細(xì)胞的重建,尤其是較幼稚的原紅細(xì)胞、中幼紅細(xì)胞及晚幼紅細(xì)胞的重建。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R-332;R392

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本文編號：1751844