發(fā)布時間：2018-04-11 10:38

  本文選題：熱休克蛋白抑制劑 + 信號通路�。� 參考：《山東大學》2017年博士論文

【摘要】：研究背景與目的熱休克蛋白70(Hsp70/HSPA1A)是細胞在應激條件(如高溫,缺氧,缺血,病毒感染,組織損傷等)下誘導表達的一種分子伴侶蛋白質(zhì),在蛋白裝配、折疊、運輸、促進受損多肽重折疊和降解等多種細胞生理過程中均發(fā)揮著重要作用。Hsp70主要由近N端的ATP結合域(ATPase結構域)和近C端的底物結合域組成。研究表明,細胞內(nèi)Hsp70表達升高與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關,并且其升高程度與惡性腫瘤分級,轉(zhuǎn)移及化療耐藥性產(chǎn)生關系密切。在乳腺癌,子宮內(nèi)膜癌,大腸癌,前列腺癌及某些類型白血病中,腫瘤細胞高表達Hsp70與不良預后密切相關;動物實驗證明敲除Hsp70基因可抑制裸鼠移植瘤模型中癌細胞的成瘤過程。Hsp70在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要地位使之成為非常有前景的抗腫瘤治療藥物靶點,HsP70抑制劑有望發(fā)展成為新一類臨床靶向治療藥物。目前已經(jīng)有研究嘗試開發(fā)各種Hsp70抑制劑,包括作用于ATP結合域的ATP模擬物,二羥嘧啶類化合物等,以及作用于底物結合域的寡核苷酸適配子,苯基乙炔磺酰胺等等。由于Hsp70在細胞的許多正常生理活動也不可或缺,作為治療藥物的Hsp70抑制劑需要具有很高的特異性,有效性和安全性。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞中,Hsp70常常不是作為一個獨立的個體發(fā)揮作用,而是與其協(xié)同蛋白(如Bag3蛋白)結合形成復合體后再作用于其它分子。Hsp70-Bag3復合體在腫瘤相關的多種細胞通路中發(fā)揮調(diào)控作用,如上調(diào)與腫瘤細胞存活和轉(zhuǎn)移有關的FoxM1通路和HuR通路等。Bag3作為支架蛋白介導了 HsP70對許多腫瘤相關信號通路分子的調(diào)控作用,特異性的干預Hsp70-Bag3復合體的形成可以在抑制Hsp70促進腫瘤形成和發(fā)展作用的同時,盡量減少對其發(fā)揮正常生理功能的影響。近年來,本課題組與Jason Gestwicki教授及其團隊合作研發(fā)出了一系列變構體抑制劑,抑制劑與Hsp70結合后可引起Hsp70構象改變,進而干預Hsp70與Bag3的結合。以YM-01為代表的第一代抑制劑在腫瘤細胞信號通路調(diào)控及抑制腫瘤生長方面達到了與敲除Hsp70基因相似的作用效果,但是該類藥物的半衰期較短,不適合臨床應用。在YM-01基礎上進一步改進得到的第二代抑制劑JG-98,在延長藥物半衰期的同時,JG-98與Hsp70親和力更強。本課題組前期研究證實JG-98可通過與Hsp70分子的ATPase結構域結合,引起Hsp70分子構象發(fā)生改變,使Hsp70停滯于ADP結合狀態(tài),阻斷Hsp70與其伴侶蛋白Bag3或其它Bag家族的蛋白形成復合體的過程,并在細胞及動物實驗中表現(xiàn)出了顯著的抗腫瘤作用。雖然JG-98的抗腫瘤效果明顯,但仍有許多問題有待探索:JG-98在腫瘤細胞中調(diào)控的細胞通路仍未完全明確;JG-98除了干擾Hsp70-Bag3復合體以外,是否還通過其他方式調(diào)控相關信號通路等。另一方面,最近研究發(fā)現(xiàn)抑制熱休克蛋白家族的另一成員HsP90達到的抗癌效果與抑制Hsp70相似,目前已有大量Hsp90抑制劑研發(fā)產(chǎn)生,其中替拉替尼(tanespimycin/17AAG)已進入Ⅱ期臨床試驗階段。有研究報道表明同時敲除Hsp70家族中的兩個主要成員基因(誘導型Hsp70和結構型Hsc73)引起的細胞生理變化與Hsp90抑制劑作用于細胞產(chǎn)生的效果相似。提示作為Hsp70抑制劑的JG-98的抗腫瘤作用可能與Hsp90抑制劑類似,若兩者抗癌機制相似,這將極大地降低JG-98的研究價值。Broad Institute Platform(博得研究所)是隸屬于麻省理工學院和哈佛大學及其附屬醫(yī)院的基因組學研究中心,Connectivity Map(Cmap)是該研究所基于RNA芯片技術研究藥物作用機制的工具和數(shù)據(jù)資源平臺,該平臺整合了目前已通過美國Food and Drug Administration(FDA)認證的所有藥物作用于多種人類腫瘤細胞后引起的基因表達圖譜變化信息,可用于全面分析藥物對腫瘤細胞全基因組水平基因表達情況的影響,并可與已知藥物或疾病進程相關基因表達圖譜比較,預測分析新研發(fā)藥物或未知試劑的作用機制。本研究通過Connectivity Map數(shù)據(jù)庫比較應用Hsp70抑制劑(JG-98)或Hsp90抑制劑(17AAG)處理不同腫瘤細胞系后,細胞基因表達圖譜的變化情況,分析JG-98作為新型抗癌藥物的研究價值;利用多種實驗技術探究乳腺癌細胞中JG-98所調(diào)控的信號通路,及其發(fā)揮調(diào)控作用的分子機制。應用慢病毒shRNA文庫篩選影響乳腺癌細胞對JG-98敏感性的相關基因,對基因進行信號通路歸納分析或結合Cmap分析結果,預測能夠增加乳腺癌細胞對JG-98敏感性的相應增效劑,并通過細胞實驗和動物實驗進行驗證;為選擇能增強JG-98抗癌效能的配伍用藥提供參考,為藥物聯(lián)合應用治療方案的制定提供新的思路和方法。材料與方法1.比較Hsp70抑制劑JG-98與Hsp90抑制劑17AAG對腫瘤細胞基因表達圖譜影響的異同。選取5種不同種類人類腫瘤細胞系,分別給予5種不同濃度JG-98或17AAG處理后,提取細胞RNA,對所得樣本進行RNA芯片檢測。通過Connectivity Map分析比較上述兩類藥物所引起的腫瘤細胞基因表達圖譜變化的異同,篩選對腫瘤細胞基因表達圖譜具有相似影響的藥物,并將兩種藥物的分析結果進行比對。2.提取JG-98處理后的乳腺癌細胞RNA并進行Microarray分析,應用基因集富集分析(gene set enrichment analysis GSEA)技術及蛋白質(zhì)磷酸化水平分析技術(可分析與細胞內(nèi)20多個主要信號通路相關的50多個重要分子的磷酸化狀態(tài)和磷酸化水平)篩選JG-98在乳腺癌細胞中所調(diào)控的信號通路。3.在前期信號通路分析實驗所得結果基礎上,選取MAPK通路,AKT通路與c-myc通路進行進一步研究,通過shRNA敲除乳腺癌細胞Bag3基因,JG-98處理細胞后,對以上信號通路相關蛋白水平進行檢測,探究JG-98對上述信號通路的調(diào)控是否與Hsp70-Bag3復合體有關,嘗試闡明JG-98調(diào)控各信號通路的具體機制。4.運用慢病毒shRNA文庫感染乳腺癌細胞后通過抗生素篩選慢病毒感染成功的細胞,并將細胞隨機分為對照組與實驗組,對照組不行藥物處理,實驗組給予JG-98藥物處理直到僅剩少量細胞(25%)存活,提取兩組細胞DNA后進行PCR擴增及測序,比較對照組與JG-98處理組中相應shRNA所占比例的變化,篩選與乳腺癌細胞JG-98敏感性相關的基因。5.分析shRNA文庫篩選所得基因,預測與乳腺癌細胞JG-98敏感性相關的信號通路,篩選調(diào)控相關通路的藥物,通過乳腺癌細胞系(MDA-MB-231,BT474)體外細胞學實驗,及裸鼠移植瘤模型實驗,探究所選藥物對JG-98的增效作用。將shRNA文庫篩選所得基因輸入Cmap數(shù)據(jù)庫,篩選可以增強乳腺癌細胞對JG-98敏感性的相關藥物,并利用乳腺癌細胞系(MDA-MB-231)進行體外細胞學實驗驗證。結果1.在Connectivity Map給出的14項與Hsp90抑制劑17-AAG作用機制最為相似的藥物記錄中,所有藥物均為HsP90抑制劑,藥物間相似度得分均高于0.89;經(jīng)過分析Hsp70抑制劑JG-98處理組細胞的RNA芯片結果,在系統(tǒng)給出的所有14項與其作用機制最為相似的藥物記錄中,并未發(fā)現(xiàn)HsP90抑制劑,且所有藥物相似度得分均低于0.65。2.GSEA系統(tǒng)分析結果顯示JG-98下調(diào)乳腺癌細胞內(nèi)176條信號通路,上調(diào)19條信號通路。對所得通路中的主要基因進行分析整合,得到以下JG-98主要下調(diào)的基因集:(1)細胞周期家族,(2)RNA處理及切割,(3)蛋白酶體,熱休克蛋白及伴侶蛋白(CCT伴侶),(4)細胞能量相關基因,包括呼吸鏈,ATP合成,Crebs循環(huán)及糖酵解,(5)細胞內(nèi)甾體合成。JG-98主要上調(diào)的基因集包括:(1)未折疊蛋白反應基因(UPR unfolded protein response),(2)晝夜周期相關基因,(3)p53/DNA損傷反應基因。3.蛋白質(zhì)磷酸化水平分析結果與GSEA結果基本吻合,經(jīng)JG-98處理后,乳腺癌細胞(MCF7)中的細胞周期相關基因受到抑制(P21和P27上調(diào)),DNA損傷反應基因激活(H2AX及Chk2蛋白磷酸化水平升高),UPR通路激活(calnexin和PDI升高)。除此之外,蛋白質(zhì)磷酸化水平分析也揭示了 JG-98在乳腺癌細胞中調(diào)控的其它通路,包括(1)下調(diào)NF-kB、FAK-Src、Notch和WNT通路;(2)激活mTOR和MAPK通路。4.Western Blot證實,經(jīng)JG-98處理后,乳腺癌細胞(MCF7)中ERK1/2的磷酸化水平明顯升高,且磷酸化升高水平隨藥物濃度增高而升高;應用shRNA敲除MCF7細胞Bag3基因后,ERK1/2的磷酸化水平明顯升高。Inter-Q實驗證實Bag3與ERK1/2在細胞中相互結合并形成復合體,且JG-98可干擾復合體的形成。qPCR結果顯示2μM JG-98處理MCF7細胞4h后,細胞內(nèi)Bag3與ERK1/2的結合量降低了 38.88%。對pho-ERK1/2去磷酸化速率的監(jiān)測實驗顯示,經(jīng)JG-98處理后,乳腺癌細胞中pho-EKR1/2去磷酸化速率明顯降低。5.Western blot證實,經(jīng)JG-98處理,乳腺癌細胞(MCF7)中pho-AKT水平及c-myc水平明顯降低;而shRNA敲除Bag3基因?qū)ho-AKT水平及c-myc水平?jīng)]有明顯影響;且使用JG-98處理敲除Bag3后的MCF7細胞,藥物對pho-AKT及c-myc的下調(diào)作用反而增強。shRNA敲除Bag1基因或Bag6基因?qū)ho-AKT水平及c-myc水平亦無明顯影響。6.對shRNA文庫基因測序篩選結果進行信號通路分析后發(fā)現(xiàn):抑制蛋白酶體相關基因可增加乳腺癌細胞對JG-98的敏感性;下調(diào)RNA聚合酶Ⅱ(RNApol Ⅱ)合成相關基因可增加敏感性;其他相關通路包括高爾基體轉(zhuǎn)運相關通路,敲低ARF1或ARFGAP1可降低敏感性,相反如果敲低ARFGEF2基因,則可增加敏感性;TGF-β通路,敲低該通路的正向調(diào)解因子TGFBP1,FNTA,SMAD2,AXIN和Usp9X可降低敏感性,而敲低該通路的負向調(diào)節(jié)因子STRAP可增加敏感性;同樣的還有WNT通路,敲低FXD3,FZD4,FZD7,FZD8,FGF8和TCF7L1增加敏感性,敲低AXIN降低敏感性。7.細胞學MTT實驗證實聯(lián)合應用蛋白酶體抑制劑(MG132)與JG-98處理乳腺癌細胞系(MDA-MB-231和BT474),對乳腺癌細胞生長的抑制和殺傷作用明顯強于單獨用藥。在MDA-MB-231細胞裸鼠皮下成瘤模型中,聯(lián)合應用蛋白酶體抑制劑硼替佐米Bortzomib與JG-98,對裸鼠皮下瘤體生長的抑制作用明顯強于單獨用藥。8.體外細胞學MTT實驗證實聯(lián)合應用RNApol Ⅱ基因抑制劑α-amanitin可明顯增強JG-98對乳腺癌細胞(HCC1937,BT549)的抑制和殺傷作用。9.應用Connectivity Map分析shRNA文庫篩選結果,提示AKT通路抑制劑(LY294002)與酪氨酸激酶受體抑制劑(sunitinib)可增加乳腺癌細胞對JG-98的敏感性。體外細胞學MTT實驗證實聯(lián)合應用以上兩種藥物均可增加JG-98對乳腺癌細胞的抑制和殺傷作用。結論1.Hsp70抑制劑(JG-98)與Hsp90抑制劑(17AAG)引起的腫瘤細胞內(nèi)基因表達圖譜的變化并不相同。JG-98的抗腫瘤機制有獨特性和創(chuàng)新性,具有較高的研究價值和較好的臨床應用前景。2.通過GSEA及蛋白質(zhì)磷酸化水平分析探究JG-98在乳腺癌細胞中所調(diào)控的部分細胞通路,為進一步了解JG-98發(fā)揮作用的具體機制提供理論依據(jù)。3.JG-98通過抑制Hsp70-Bag3復合體的形成,干擾Bag3與ERK1/2結合,影響MKP3磷酸激酶對ERK1/2的去磷酸化,減緩ERK1/2的去磷酸化速率,引起ERK1/2的活化水平升高。4.JG-98下調(diào)AKT通路和c-myc通路,使乳腺癌細胞內(nèi)pho-AKT水平和c-myc水平降低,且對以上通路的下調(diào)作用與Bag1,Bag3及Bag6無關。5.蛋白酶體抑制劑(MG132/硼替佐米bortzomib),RNApol Ⅱ基因抑制劑(α-amanitin),AKT通路抑制劑(LY294002),酪氨酸激酶受體抑制劑(sunitinib)都可增加乳腺癌細胞對JG-98的敏感性,可作為選擇JG-98增效劑及配伍用藥的理論依據(jù)。6.shRNA文庫篩選結合信號通路分析或聯(lián)合Connectivity Map都可作為預測抗腫瘤藥物增效劑的有效手段。意義1.應用基因表達圖譜分析方法(Connectivity Map)鑒定了 Hsp70抑制劑JG-98與Hsp90抑制劑17AAG之間抗腫瘤機制的不同;2.首次揭示了 JG-98在乳腺癌細胞中所調(diào)控的信號通路,并驗證了 Hsp70-Bag3復合體在部分通路調(diào)節(jié)中的地位,即JG-98既通過Bag3依賴方式也通過Bag3非依賴方式進行信號通路調(diào)控;闡明乳腺癌細胞中JG-98上調(diào)MAPK通路的作用機制;3.首次提出通過shRNALibrary篩選得到藥物敏感性相關基因,進行基因信號通路分析或結合Connectivity Map的方法預測藥物增效劑,為臨床選擇抗腫瘤聯(lián)合用藥提供了新思路新方法。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

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本文編號：1735647