本文選題：mi　切入點：R-146b　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：研究背景20世紀(jì)以來,隨著篩查和治療技術(shù)的進步,先心病的治愈率顯著提升,但是復(fù)雜型先心病死亡率仍然很高。紫紺型先心病是較為常見的復(fù)雜型先心病。在紫紺型先心病中,心臟血流由右向左分流導(dǎo)致的慢性缺氧是此類先心病共有的病理生理過程。雖然紫紺型先心病的患者長期處于慢性缺氧狀態(tài),但他們大多數(shù)人能耐受這種缺氧存活,直至合適的手術(shù)時期。已有的研究證實,心肌慢性缺氧適應(yīng)性改變能增強心肌細(xì)胞對多種外界刺激的耐受,但這其中的機制并未完全闡明。因此,研究慢性缺氧條件下心肌細(xì)胞的適應(yīng)機制可能為改善臨床治療效果,降低缺氧性心臟病的死亡率做出貢獻。MicroRNAs(miRNAs)是內(nèi)源性,短鏈單鏈非編碼RNA。mi RNA基因以單拷貝,多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組中,mi RNA與靶mRNA配對,通過形成誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(miRISC),抑制mRNA翻譯或加速m RNA降解,參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。miRNA被證實在心臟發(fā)育以及疾病的病理進程中都發(fā)揮重要作用。例如,mi R-1促進胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化,而mi R-133抑制胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。敲除mi R-21促進心肌細(xì)胞肥大,而過表達miR-21心肌肥厚反應(yīng)減弱。過表達mi R-208a將導(dǎo)致心肌肥厚和心律失常。查閱法洛氏四聯(lián)癥mi R-array表達譜差異的文獻,我們發(fā)現(xiàn)miR-146b在法洛氏四聯(lián)癥高表達。以其他細(xì)胞缺氧模型為參考,mi R-146b在肺上皮細(xì)胞缺氧情況下高表達。北京安貞醫(yī)院一組研究人員研究發(fā)現(xiàn),小型豬紫紺性心臟病模型中,mi R-146b在肺組織中高表達。這些結(jié)果都提示mi R-146b可能參與慢性缺氧心肌病理改變,其調(diào)控的方式還未見報道。核糖核酸酶L(ribonuclease L,RNase L)是2-5A系統(tǒng)成員,屬于MX家族。研究表明RNase L誘導(dǎo)依賴caspase級聯(lián)酶的細(xì)胞凋亡。此外,凋亡發(fā)生時,RNase L從胞漿移動到線粒體,改變ΔΨM(線粒體膜電位),產(chǎn)生活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)。敲除RNase L后,相對于未敲除組細(xì)胞凋亡明顯減少,研究表明這部分是由JNK/c-Jun通路介導(dǎo)的。RNase L也可以通過間接影響IKK-κ和IKK-α影響NF-κB通路。tissue-specificgeneexpressionandregulation(tiger)數(shù)據(jù)庫顯示rnaselmrna在心臟組織中高表達,這表明它可能在心肌細(xì)胞病理生理進程中起到重要作用。研究目的本實驗擬在體內(nèi)(臨床心肌標(biāo)本)和體外(細(xì)胞)兩個水平檢測慢性缺氧條件下mir-146b的表達變化。在體外心肌細(xì)胞慢性缺氧模型中使用抑制劑改變mir-146b的表達,檢測改變mir-146b表達對缺氧h9c2心肌細(xì)胞的影響。同時通過生物信息學(xué)預(yù)測并由報告基因?qū)嶒灤_認(rèn)mir-146b的靶基因。隨后檢測缺氧時下調(diào)mir-146b是否導(dǎo)致nf-κb和stat3的激活。最后我們下調(diào)靶基因rnasel,研究該基因在心肌細(xì)胞慢性缺氧中可能的作用。研究方法本研究分五部分:1.體內(nèi)(臨床心肌標(biāo)本)和體外(細(xì)胞)兩個水平檢測缺氧對mir-146b表達影響。1.1收集人心肌標(biāo)本,紫紺組病人患有法洛四聯(lián)癥或肺動脈閉鎖合并室間隔缺損,非紫紺組病人患有右室流出道狹窄合并室間隔缺損),標(biāo)本于手術(shù)中取自右室流出道。提取組織rna,采用rt-pcr檢測mir-146b在兩組病人標(biāo)本中的表達情況。1.2將同一批次h9c2(大鼠心室肌細(xì)胞系)細(xì)胞置于低氧培養(yǎng)箱(1.0%o2、5.0%co2)中分別培養(yǎng)24h、48h及72h,對照組置于普通培養(yǎng)箱(21.0%o2)中培養(yǎng),利用rt-pcr技術(shù)檢測在心肌細(xì)胞系中隨著缺氧時間的延長mir-146b表達情況。2.探索mir-146b在h9c2細(xì)胞慢性缺氧中的作用及調(diào)控機制:2.1常氧時在h9c2細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染帶綠色熒光的陰性對照,通過熒光顯微鏡觀測轉(zhuǎn)染效率。2.2向部分h9c2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的mir-146binhibitor(后簡稱146b-inh),建立常氧,慢性缺氧,慢性缺氧+轉(zhuǎn)染146b-inh,慢性缺氧+轉(zhuǎn)染146b-inhnc四個實驗組。通過ldh細(xì)胞毒性檢測,流式annexinv-fitc/pi檢測,hoechst染色,tunel染色,jc-1染色這幾種實驗方法測量各組細(xì)胞損傷或凋亡程度,探索下調(diào)mir-146b對缺氧心肌細(xì)胞損傷和凋亡的影響;利用western-blot方法檢測凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspse3,bcl-2和bax在各組中的表達情況;3.利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫targetscan預(yù)測mir-146b的靶基因。構(gòu)建靶基因rnasel的野生型及突變型雙熒光素酶報告基因,將mir-146bmimic或其nc與野生型或突變型報告基因共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞,然后利用熒光照度計檢測報告基因相對熒光值,以此檢測mir-146b與rnaselmrna是否能物理結(jié)合;同時采用western-bolt技術(shù),在h9c2細(xì)胞系中通過轉(zhuǎn)染146b-inh下調(diào)mir-146b后,檢測心肌細(xì)胞系中rnasel蛋白的表達變化。4.western-bolt檢測轉(zhuǎn)染mir-146binhibitor后缺氧情況下h9c2細(xì)胞中nf-κb信號通路關(guān)鍵蛋白p65及其磷酸化形式的表達變化,以及stat3蛋白及其磷酸化形式的表達變化。5.初步研究rnasel在心肌慢性缺氧中的表達及作用:5.1免疫組化檢測rnasel在人心肌組織中的表達情況。5.2在前述1.2構(gòu)建的慢性缺氧心肌細(xì)胞模型中,利用rt-pcr及western-bolt技術(shù)檢測缺氧后rnaselmrna和蛋白的表達變化,以及rli蛋白表達變化。5.3設(shè)計并化學(xué)合成rnaselsirna,轉(zhuǎn)染h9c2細(xì)胞,利用rt-pcr方法檢測干擾效率,選取有效的sirna干擾序列。5.4利用流式annexinv-fitc/pi檢測缺氧情況下轉(zhuǎn)染rnaselsirna對凋亡的影響;實驗結(jié)果1.rt-pcr結(jié)果顯示mir-146b在紫紺型和非紫紺型先心病病人標(biāo)本表達存在顯著差異,前者是后者的1.40倍(p0.05)。2.rt-pcr結(jié)果顯示在h9c2心肌細(xì)胞中mir-146b的表達量隨著缺氧時間的延長而逐漸增加,并在72h達到頂峰,達到常氧對照組的1.97倍(p0.05)。3.將inhibitor熒光陰性對照轉(zhuǎn)染h9c2細(xì)胞,熒光顯微鏡觀測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率達到75%以上。心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染mir-146b化學(xué)模擬物或抑制劑后缺氧72h,ldh細(xì)胞毒性實驗結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染mir-146bmimic可顯著減少細(xì)胞死亡(死亡率下降20.3%,p0.05),而轉(zhuǎn)染mir-146binhibitor則起到相反的結(jié)果(死亡率升高64%,p0.05)。我們接著利用流式annexinv-fitc/pi,tunel染色,hoechst染色及jc-1染色檢測缺氧心肌凋亡情況,結(jié)果顯示與nc組相比,轉(zhuǎn)染mir-146binhibitor均能顯著增加細(xì)胞凋亡(所有p0.05)。同時western-blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染mir-146binhibitor后,cleaved-caspase3、bax的蛋白量顯著增加(分別升高73.0%和72.8%,p0.05),而bcl-2的表達下降37.2%(p0.05),bcl-2/bax也有明顯降低(下降64.0%,p0.05)。4.雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染mimic與野生型報告基因后可顯著降低熒光強度(下降30.9%,P0.05),而共轉(zhuǎn)染突變型報告基因與mimic則沒有這種差異(P0.05)。同時在H9c2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mi R-146b inhibitor后,RNase L蛋白表達增加6.61倍(P0.05)。5.H9c2心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi R-146b抑制劑后缺氧培養(yǎng)72h,Western-Blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-146b inhibitor并沒有改變p65和STAT3蛋白表達(P0.05),但這兩個蛋白的磷酸化水平顯著增加,分別為對照組的2.2倍和1.27倍(P0.05)。6.免疫組化結(jié)果顯示在人心肌組織標(biāo)本中,RNase L高表達于心肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞,而較低表達于間質(zhì)細(xì)胞(如血管內(nèi)皮細(xì)胞)。7.利用RT-PCR和Western-Blot檢測發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞缺氧后,RNase L m RNA和蛋白表達逐漸下調(diào)(RNase L m RNA缺氧72h與0h相比下降61.0%,P0.05),而它的抑制因子(RLI)蛋白表達增加。8.利用RT-PCR檢測沉默效率,發(fā)現(xiàn)設(shè)計的3對RNase L si RNA僅1對能有效沉默靶標(biāo)基因,使RNase L m RNA水平下調(diào)52.3%(P0.05)。在H9c2細(xì)胞中干擾RNase L表達后置于缺氧孵箱中培養(yǎng)72h,流式Annexin V-FITC/PI檢測缺氧心肌的凋亡,結(jié)果顯示RNase L si RNA轉(zhuǎn)染組中凋亡細(xì)胞數(shù)量低于對照組(4.36%vs.NC 12.4%)。結(jié)論1.在病人心肌標(biāo)本中,紫紺組mi R-146b表達高于非紫紺組,同時在體外慢性缺氧H9c2細(xì)胞模型中,隨著缺氧時間延長mi R-146b表達緩慢上升。2.在H9c2細(xì)胞系中,下調(diào)mi R-146b可顯著增加缺氧所致的心肌凋亡。3.生物信息學(xué)預(yù)測,同時雙熒光素酶報告基因和Western-Blot實驗證實RNase L為mi R-146b靶基因4.并且在心肌慢性缺氧模型中下調(diào)mi R-146b表達,NF-κB信號通路激活增加,STAT3磷酸化水平增加。5.RNase L蛋白在人心肌組織中表達,高表達于心肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞,而較低表達于間質(zhì)細(xì)胞。H9c2細(xì)胞缺氧后RNase L在mRNA及蛋白水平都隨著缺氧時間延長逐漸降低,而RLI蛋白表達對應(yīng)增加。下調(diào)RNase L表達,缺氧導(dǎo)致的心肌凋亡減少。其具體的作用機制有待進一步研究。
[Abstract]:In the 20th century , with the progress of screening and treatment technology , the cure rate of congenital heart disease is obviously improved , but the mortality of complex congenital heart disease is still high . The effect of mir - 146b on the expression of NF - 魏B and stat3 in cardiac muscle cells was studied . Conclusion : 1 . The expression of RNase L in human cardiac muscle tissue is higher than that of non - cyanosis group .

【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R541.1

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本文編號：1685808