本文選題：創(chuàng)面愈合　切入點：LED紅光　出處：《第二軍醫(yī)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景:創(chuàng)面愈合整個過程是一個非常復雜的過程,創(chuàng)面因為局部外傷或者病變使得皮膚完整性遭受破壞而形成的損傷。初期,創(chuàng)面內不同的信號通路就已經激活,便進入創(chuàng)面愈合的生理步驟。一般分為四個不同的時期:出血期,炎癥期,增殖期以及重塑期。不同的時期包含各種不同的影響因素。創(chuàng)面愈合開始后,創(chuàng)周成纖維細胞增殖并合成分泌膠原為角質形成細胞移行鋪平道路,而角質形成細胞先是通過解離細胞間以及細胞和基質之間的粘附和連接,細胞肌動蛋白微絲重排等來驅使細胞不斷地向創(chuàng)面中心移動。而這過程受生長因子,細胞因子,趨化因子,抗菌肽,氧分壓以及金屬蛋白酶基質等諸多因素的影響。當然創(chuàng)面愈合是個多步驟,由多種細胞共同完成的過程,創(chuàng)面再上皮化(re-epithelialization)作為其中的關鍵環(huán)節(jié),在表皮屏障的完整性恢復中起著至關重要的作用。HIF-1α是一種十分重要的轉錄因子,一般認為在低氧條件下被調控基因轉錄,參與細胞的各種代謝及其他生物學功能。HIF-1α參與調控60多種基因,并調控細胞的增殖以及移行,而細胞的增殖移行在創(chuàng)面愈合中也發(fā)揮重要作用。HIF-1α表達升高可以明顯改善糖尿病的創(chuàng)面愈合。有文獻報道抑制HIF-1α表達可以明顯使得成纖維細胞移行減慢,而上調HIF-1α表達則可以明顯加快成纖維細胞移行。在人的角質形成細胞中,HIF-1α可以提高細胞的移行,但是具體機制仍然不是很清楚。因此,研究HIF-1α對角質形成細胞移行調控十分重要。目前,臨床上有很多方法用來治療創(chuàng)面愈合。包含生長因子的使用,負壓吸引,敷料包扎。最近,還出現了一些物理療法,比如電場,磁場的應用。而進年來光療在創(chuàng)面上應用也得到了極大普及和發(fā)展。而且被證明是十分有效的手段。低能量的激光可以很好的改善創(chuàng)面愈合。這一結論已被很多實驗證實,而LED燈光和激光也有著同樣的效果。本文主要介紹紅光(640nm)對創(chuàng)面角質形成細胞移行的影響。雖然很多報道光照可以促進創(chuàng)面愈合,但是較少報道具體闡述其分子機制,因此,本文闡述了紅光對角質形成細胞移行的影響,以及其分子HIF-1α表達變化。光照確實可以改變細胞的骨架形態(tài),在He La細胞和內皮細胞中HIF-1α表達升高后細胞骨架得到改變。所以我們假設在角質形成細胞中,光照是否一樣可以通過改變角質形成細胞的骨架形態(tài)進而調節(jié)細胞的移行。本文通過上調以及降低角質形成細胞HIF-1α的表達觀察角質形成細胞骨架的變化,并同時探討了紅光在阻斷HIF-1α下對細胞骨架的影響。從而分析紅光對角質形成細胞移行的具體分子機制。研究方法:1.利用人術后包皮組織提取分離原代角質形成細胞,應用紅光照射后在活細胞工作站動態(tài)拍攝技術下觀察單個角質形成細胞的運動性,并使用Image J軟件進行分析,同時使用人皮膚角質化細胞片層劃痕制作體外細胞創(chuàng)面愈合模型。觀察劃痕后單層細胞創(chuàng)面愈合面積的變化來觀察640nm紅光對人角質形成細胞遷移的影響。同時應用CCK-8檢測紅光對細胞增殖的影響。2.同上述方法紅光照射后,然后運用WB法檢測光照后的人原代角質形成細胞中HIF-1α表達變化。同時應用鬼筆環(huán)肽熒光染色觀察光照對人角質形成細胞在光照后骨架的改變。用Image J軟件分析骨架改變情況。3.培養(yǎng)分離人角質形成細胞后,分別單純應用DMOG和COCL2處理角質形成細胞以上調其HIF-1α的表達來觀察細胞骨架的改變,并用WB方法驗證上調后蛋白表達情況。細胞骨架的免疫染色同上述方法。4.YC-1是HIF-1α特異性阻斷劑,在同上述光照及分組方法,在光照下應用YC-1阻斷HIF-1α的表達來觀察人原代角質形成細胞骨架的改變。結果:1.LED光照促進角質形成細胞的運動和移行。體外細胞實驗中,LED紅光(12 J/cm2 and 24 J/cm2)與對照組相比,單個角質形成細胞在活細胞工作站觀察下運動性增加,其中12 J/cm2更為明顯,所以在細胞劃痕實驗中,主要選擇的紅光能量也是12 J/cm2。在此能量下,角質形成細胞移行也更為顯著。應用CCK-8試劑盒檢測不同實驗組細胞增殖,提示光照組和對照組沒有明顯差異。2.LED光源增加角質形成細胞HIF-1α的表達并促進細胞骨架重排通過分析紅光照射3,6,12小時后HIF-1α的表達情況,可以發(fā)現紅光照射可以明顯上調角質形成細胞HIF-1α蛋白表達,同時紅光照射組細胞形態(tài)也展開明顯,通過鬼筆環(huán)肽熒光染色也可以發(fā)現F-actin表達非常明顯。3.HIF-1α激動劑氯化鈷和DMOG可明顯促進角質形成細胞F-actin的表達通過WB方法證明分別單獨可以促進角質形成細胞HIF-1α蛋白的表達,同時Co Cl2(100μM、200μM)和DMOG(0.5 m M、1 m M)處理的細胞骨架也明顯改變,熒光染色的細胞F-actin表達也更為強烈。4.HIF-1α特異性抑制劑YC-1可以通過阻斷HIF-1α抑制光照對細胞骨架的調節(jié)。YC-1是特異性HIF-1α阻斷劑,通過WB方法檢測不同實驗組(光照與非光照同時添加YC-1 0,20和50μM)證實YC-1可阻斷紅光上調角質形成細胞HIF-1α蛋白表達的作用。同時,通過熒光染色細胞骨架比較不同實驗組發(fā)現,YC-1可以通過降低HIF-1α的表達抑制光照對細胞骨架表達的積極作用。結論本章節(jié)研究發(fā)現LED紅光(640nm)明顯提高人角質形成細胞的運動性以及細胞移行,但對細胞增殖沒有促進作用。LED光能明顯上調角質形成細胞HIF-1α的表達,同時促進細胞F-actin的表達,而此與細胞的移行密切相關。單純的HIF-1α促進劑處理角質形成細胞后也可以促進細胞F-actin的表達,而YC-1可以抑制HIF-1α的表達,同時抑制了紅光對細胞骨架表達的積極作用。所以我們可以得出LED紅光是通過HIF-1α改變細胞骨架,從而調控角質形成細胞移行,進一步影響再上皮化和創(chuàng)面愈合的過程。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R64

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