本文選題：多發(fā)性骨髓瘤　切入點(diǎn)：耐藥　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景:多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一種單克隆漿細(xì)胞惡性增殖性疾病,臨床表現(xiàn)主要包括高鈣血癥、腎功能受損、貧血及溶骨性病變。目前MM發(fā)病率居血液系統(tǒng)惡性腫瘤第二位,僅次于淋巴瘤。MM的治療藥物主要包括傳統(tǒng)化療藥及新藥,隨著新藥(硼替佐米、雷那度胺等)及自體干細(xì)胞移植的應(yīng)用,MM患者的生存已經(jīng)得到極大的改善和提升,但由于原發(fā)及繼發(fā)耐藥的發(fā)生,大部分MM患者最終進(jìn)展復(fù)發(fā),使MM目前仍不可治愈。因此進(jìn)一步探究MM的耐藥機(jī)制,尋找克服耐藥或增加藥物敏感性的方法,是臨床上迫切需要解決的問題。高遷移率族蛋白B1(high-mobility groupboxl,HMGB1)作為一種非組蛋白染色體結(jié)合蛋白,在DNA重組、修復(fù)及靶基因轉(zhuǎn)錄中起重要作用,同時(shí)HMGB1能夠被分泌或釋放至細(xì)胞外作為一種損傷相關(guān)模式分子(damage associated molecular patterns,DAMPs)與其受體結(jié)合參與炎癥、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移、血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥等。研究發(fā)現(xiàn)HMGB1在多種腫瘤中過表達(dá),參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥,在血液系統(tǒng)惡性腫瘤如白血病、淋巴瘤中也發(fā)現(xiàn)有HMGB1的過表達(dá),化療藥物促進(jìn)白血病細(xì)胞釋放HMGB1,從而使其拮抗凋亡,同時(shí)HMGB1還能夠通過增加自噬誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的耐藥。TLR4是HMGB1的重要受體之一,HMGB1能夠通過結(jié)合TLR4參與炎癥、血管生成、腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移等過程。我們前期研究發(fā)現(xiàn)TIR4的外源性配體脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)能夠通過與TLR4結(jié)合活化MM細(xì)胞內(nèi)NF-1κB和MAPK信號(hào)途徑,促進(jìn)MM細(xì)胞增殖,同時(shí)能夠抑制化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。而在進(jìn)一步研究中我們發(fā)現(xiàn)MM細(xì)胞能夠分泌TLR4的內(nèi)源性配體HMGB1。作為染色體結(jié)合蛋白及損傷相關(guān)模式分子,HMGB1是否介導(dǎo)MM耐藥的發(fā)生并不清楚,因此本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上深入探索HMGB1在MM耐藥中的作用及機(jī)制。研究目的:1.明確原代MM細(xì)胞及MM細(xì)胞系中HMGB1的表達(dá)及分泌情況;2.構(gòu)建干擾HMGB1的慢病毒載體轉(zhuǎn)染MM細(xì)胞,明確內(nèi)源性HMGB1在MM生長(zhǎng)及耐藥中的作用;3.分析化療藥物處理后MM細(xì)胞培養(yǎng)上清中HMGB1的變化,明確外源性HMGB1對(duì)MM細(xì)胞生長(zhǎng)及耐藥的影響;4.體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探索HMGB1介導(dǎo)MM耐藥的機(jī)制。研究方法:1.利用Western blot、qRT-PCR、免疫熒光技術(shù)及流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)MM患者原代標(biāo)本及 MM 細(xì)胞株(MM.1S、RPMI8226、ARK、ARP-1、CAG、NCI-H929)中HMGB1及其受體的表達(dá)情況;ELISA方法檢測(cè)MM患者骨髓上清中HMGB1的分泌情況及化療藥物處理后細(xì)胞培養(yǎng)上清中HMGB1的變化;2.用外源性重組蛋白HMGB1(rhHMGB1)預(yù)處理MM細(xì)胞,利用MTT、CCK-8、流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)外源性HMGB1對(duì)MM細(xì)胞增殖及藥物誘導(dǎo)凋亡的影響;3.慢病毒載體構(gòu)建干擾HMGB1的MM細(xì)胞株(RPMI8226、CAG、MM.1S、ARK),利用CCK-8、流式細(xì)胞分析術(shù)、Western blot檢測(cè)內(nèi)源性HMGB1對(duì)MM細(xì)胞增殖及藥物誘導(dǎo)凋亡的影響;4.基因表達(dá)譜芯片篩選干擾HMGB1的MM細(xì)胞及其對(duì)照MM細(xì)胞中的差異基因,qRT-PCR及Western blot驗(yàn)證芯片結(jié)果,并進(jìn)一步探索相關(guān)信號(hào)通路的變化及其對(duì)MM細(xì)胞耐藥的影響;5.通過NOD/SCID小鼠皮下注射HMGB1干擾及對(duì)照組MM細(xì)胞(MM.1S-HMGB1 shRNA 及 MM.1S-control shRNA)構(gòu)建 MM 移植瘤小鼠模型,測(cè)量小鼠腫瘤體積同時(shí)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腫瘤組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)。研究結(jié)果:1.Western blot、qRT-PCR結(jié)果顯示HMGB1 在MM細(xì)胞株MM.1S、RPMI8226、ARK、ARP-1、CAG、NCI-H929及原代MM細(xì)胞(患者骨髓CD138+細(xì)胞)中均表達(dá),qRT-PCR及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示MM細(xì)胞株及原代MM細(xì)胞差異性表達(dá)HMGB1受體RAGE、TLR2、TLR4和TLR9,ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示MM細(xì)胞株及MM患者骨髓上清中均存在HMGB1的分泌;免疫熒光結(jié)果顯示MM患者骨髓中CD138+漿細(xì)胞表達(dá)HMGB1;2.硼替佐米(bortezomib,Bor)及阿霉素(Adriamycin,ADM)能夠顯著抑制MM細(xì)胞的增殖同時(shí)伴隨MM細(xì)胞培養(yǎng)上清中HMGB 1釋放的增加;rhHMGB1預(yù)處理MM細(xì)胞后CCK8結(jié)果顯示rhHMGB 1對(duì)MM細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響;MTT及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示rhHMGB1對(duì)Bor、ADM及地塞米松(Dexamethasone,Dex)誘導(dǎo)的MM細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響;3.CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果顯示干擾HMGB1后,MM細(xì)胞本身的增殖無(wú)顯著變化,而Dex抑制MM細(xì)胞增殖的能力增強(qiáng)(P0.05)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示干擾HMGB1對(duì)地Dex誘導(dǎo)的MM細(xì)胞周期阻滯無(wú)明顯影響。Annexin V-APC凋亡分析結(jié)果顯示干擾HMGB1后Dex、ADM及馬法蘭誘導(dǎo)的MM細(xì)胞凋亡顯著增加(P0.05)。Western blot結(jié)果顯示干擾HMGB1后地塞米松誘導(dǎo)的cPARP及c-Caspase3增加;4.基因表達(dá)譜芯片顯示干擾HMGB1后的RPMI8226及CAG中MM細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及凋亡相關(guān)基因顯著變化,其中MM細(xì)胞促生長(zhǎng)基因DEPTOR表達(dá)下降,抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl表達(dá)下降,qRT-PCR(P0.05)及Western blot驗(yàn)證了上述結(jié)果;5.Western blot進(jìn)一步檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)干擾HMGB1后MM細(xì)胞內(nèi)mTOR通路活化增加、饑餓誘導(dǎo)的MM細(xì)胞自噬減少、Dex誘導(dǎo)的p38MAPK激活增加、NF-1κB通路受抑制;6.Western blot結(jié)果顯示干擾HMGB1后MM細(xì)胞本身及藥物誘導(dǎo)的MM細(xì)胞內(nèi)DNA損傷效應(yīng)蛋白γH2A.X表達(dá)水平增加,7.體內(nèi)小鼠荷瘤結(jié)果顯示干擾HMGB1后抗凋亡蛋白Bcl-2、mTOR底物蛋白p4EBPl表達(dá)下降,pAkt(ser473)、γH2A.X表達(dá)增加,同時(shí)地塞米松用藥后c-caspase3、γH2A.X表達(dá)增加,HMGB1干擾組小鼠腫瘤負(fù)荷顯著低于對(duì)照組(P0.05)。結(jié)論:1.原代MM細(xì)胞及MM細(xì)胞株普遍表達(dá)HMGB1及其受體,同時(shí)能夠分泌HMGB1;2.化療藥物能夠促進(jìn)MM細(xì)胞培養(yǎng)上清中HMGB1的釋放增加,但外源性rhHMGB1對(duì)MM細(xì)胞的增殖無(wú)影響,且不能保護(hù)MM細(xì)胞免受化療藥物誘導(dǎo)的凋亡;3.干擾HMGB1后MM細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性顯著增加;4.內(nèi)源性HMGB1可能通過影響MM增殖凋亡相關(guān)基因的表達(dá)及相關(guān)信號(hào)通路的異常調(diào)控從而影響MM細(xì)胞對(duì)化療藥物的反應(yīng),參與MM耐藥;5.內(nèi)源性HMGB1可能通過調(diào)控MM細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)途徑參與MM細(xì)胞耐藥的發(fā)生。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R733.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 Zhe Liu;Yuanhong Xu;Jin Long;Kejian Guo;Chunlin Ge;Ruixia Du;;microRNA-218 suppresses the proliferation, invasion and promotes apoptosis of pancreatic cancer cells by targeting HMGB1[J];Chinese Journal of Cancer Research;2015年03期

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本文編號(hào)：1580054