發(fā)布時間：2018-03-06 06:44

  本文選題：HDAC7　切入點：Nur77　出處：《山東大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究目的與意義學習記憶是大腦的高級功能之一,在我們生存和生活過程中發(fā)揮著重要作用。認清學習記憶發(fā)生的本質(zhì),不僅可以幫助我們更好的認識及改造世界,也能為臨床上以學習記憶能力異常為主要特征的某些神經(jīng)精神疾病,如阿爾茲海默氏病、創(chuàng)傷后應激障礙(PTSD)、成癮等的治療,提供有效的治療靶點和治療方案�；蜣D(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成的動態(tài)變化以及由其導致的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及功能的可塑性,在形成記憶的過程中發(fā)揮著非常重要的作用。目前已知,特定神經(jīng)環(huán)路中的特定神經(jīng)元內(nèi)一系列關(guān)鍵分子及其下游信號通路的激活,是上述過程的前提,但是由于這些關(guān)鍵分子的變化時間有限(從幾小時至幾天,最長不過幾個月),并不能維持基因轉(zhuǎn)錄及蛋白合成的長期變化,提示我們學習記憶的形成及保存還需另外的機制參與。近期研究發(fā)現(xiàn),表觀遺傳(epigenetic)修飾對基因轉(zhuǎn)錄的持續(xù)調(diào)控,在長期記憶的過程中發(fā)揮重要作用。表觀遺傳修飾即在保持核苷酸序列不變的情況下,通過改變?nèi)旧|(zhì)的空間構(gòu)型、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子與相關(guān)基因的結(jié)合,來影響基因的表達,主要包括組蛋白的修飾(包括乙�；�、甲基化、磷酸化等)、DMA甲基化修飾、染色質(zhì)重塑和非編碼RNA等作用方式。其中乙�；揎梻涫荜P(guān)注,發(fā)現(xiàn)其動力學變化在多種認知過程以及神經(jīng)精神疾病中發(fā)揮重要作用。乙�；砂l(fā)生于每一個組蛋白的多個位點上,嚴格受到兩種作用完全相反的酶,組蛋白乙�；D(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase,HAT)和組蛋白去乙�；�(histone deacetylase,HDAC)的動態(tài)調(diào)控。HAT激活后將乙酰輔酶A的乙�；D(zhuǎn)移到組蛋白氨基末端特定的賴氨酸殘基上,主要使DNA與組蛋白的親和力降低,有利于各種轉(zhuǎn)錄因子連同協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子與DNA相應位點特異性結(jié)合,激活特定基因的轉(zhuǎn)錄,促進大腦的認知能力。而HDAC則促進組蛋白去乙�；�,從而促進組蛋白與DNA緊密結(jié)合,染色質(zhì)更加致密卷曲,基因的轉(zhuǎn)錄因此受到抑制,從而在多個腦區(qū)中對學習記憶能力進行負調(diào)節(jié)。目前研究表明HDAC在學習記憶中發(fā)揮重要作用,機體內(nèi)有HDAC共4類,18種(HDAC1-11和SIRT1-7),不同的HDAC在學習和記憶中發(fā)揮不同的作用。有研究表明敲除小鼠海馬CA1區(qū)HDAC3,可以增強方位認知能力但是不影響新奇物體認知能力;HDAC5敲除小鼠表現(xiàn)出空間記憶能力缺失,但不影響聯(lián)想學習記憶的形成;過表達HDAC1可以促進恐懼記憶的消退,但不影響恐懼記憶的形成。使用HDAC的抑制劑可以有效增強動物在條件性恐懼記憶、物體方位認知,新奇物體認知,食物偏好及空間記憶測試中的表現(xiàn),提示抑制HDAC的活性可以增強學習記憶能力,并有望成為改善人類記憶缺陷的新方法。但目前使用的HDAC抑制劑具有廣譜性,而通過作用于何種特異性的HDAC發(fā)揮改善記憶的作用仍不清楚,這極大限制了選擇性HDAC抑制劑的開發(fā)和應用。因此進一步闡明不同HDAC在學習和記憶中的作用及機制,將為開發(fā)特異性HDAC抑制劑提供重要的理論依據(jù)。環(huán)境依賴性恐懼記憶(contextual fear conditioning,CFC)是一種經(jīng)典的學習記憶模型,可以分別檢測學習記憶的獲得,短時記憶和長時記憶的形成。對CFC訓練后海馬CA1腦區(qū)進行基因芯片的篩選發(fā)現(xiàn),包含HDAC7在內(nèi)的多種HDACs發(fā)生了明顯的變化,提示HDAC可能在其中發(fā)揮重要作用。HDAC7是Ⅱ類HDAC,研究多集中于心血管及免疫等非神經(jīng)系統(tǒng),但其在學習記憶中的作用及機制尚未見報道。為此,本課題應用CFC模型及體內(nèi)外實驗研究HDAC7在學習和記憶中的作用及其機制。研究表明在CFC后小鼠背側(cè)海馬(dorsal hippocampus,DH)腦區(qū)中HDAC7表達明顯下降;過表達或者干擾HDAC7可以明顯改變小鼠CFC學習記憶的能力,提示HDAC7在學習記憶中發(fā)揮重要作用。進一步通過蛋白質(zhì)譜篩選、免疫共沉淀及體內(nèi)外泛素化實驗研究表明CFC記憶形成過程中E3連接酶CBX4參與了 HDAC7的降解,并發(fā)現(xiàn)HDAC7通過調(diào)控下游效應分子Nur77參與到環(huán)境依賴恐懼記憶的調(diào)控,本課題充實和完善了對HDAC7在學習記憶中生物學功能的認識,為臨床相關(guān)疾病治療提供新的靶點和思路,具有重要的理論意義和潛在的應用價值。研究方法1.HDAC7在環(huán)境依賴恐懼記憶形成過程中的生理學變化1.1 環(huán)境依賴恐懼記憶模型的構(gòu)建及HDAC7的檢測選取年齡為12周的雄性野生型(wildtype,WT)C57BL/6J小鼠。單只分籠放在環(huán)境依賴恐懼記憶模型(contextual fear conditioning,CFC)訓練房間適應一晚上,然后進行實驗。將小鼠柔和的放入CFC訓練箱內(nèi),使其自由活動適應箱內(nèi)環(huán)境2min,然后分別給予三次足底電擊(0.4 mA或0.7 mA)2s,每兩次足底電擊之間的間隔為58s。最后一次足底電擊后,小鼠在訓練箱中再放置58s,然后放回飼養(yǎng)籠中,繼續(xù)單只飼養(yǎng)。整個訓練過程一共持續(xù)5min。在實驗所需的時間點處死小鼠,斷頭取材。使用蛋白質(zhì)免疫印跡法(western blot,WB)、Real-time RT-PCR 和免疫組織化學法(immunohistochemistry,IHC)檢測 HDAC7 通過 CFC 訓練后在背側(cè)海馬(dorsal hippocampus,DH)腦區(qū)中表達變化。1.2 HDAC7變化的特異性CFC模型建立成功后6h處死小鼠,斷頭取腦。用腦模具將小鼠的背側(cè)海馬(dorsal hippocampus,DH)、腹側(cè)海馬(ventral hippocampus,VH)和基底外側(cè)杏仁核(basolateral amygdale,AMY)分別取出,使用蛋白質(zhì)免疫印跡法(western blot,WB)檢測HDAC7蛋白水平在不同腦區(qū)的變化,以及在背側(cè)海馬(dorsal hippocampus,DH)腦區(qū),不同HDACs的蛋白水平的變化。1.3 環(huán)境及恐懼記憶的偶聯(lián)引起HDAC7的生理學變化單籠飼養(yǎng)的小鼠,分別進行CFC訓練,足底電擊單因素刺激(shock,只用電擊板快速給予小鼠足底電擊)和環(huán)境單因素刺激(context,把小鼠放入CFC訓練箱內(nèi)5min,不給予足底電擊)。訓練后6h處死小鼠,斷頭取腦,使用蛋白質(zhì)免疫印跡法(western blot,WB)檢測HDAC7蛋白水平在不同刺激中的變化。2.HDAC7在小鼠環(huán)境依賴恐懼記憶形成過程中的作用2.1 病毒的構(gòu)建及效率檢測用四質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染293T細胞進行病毒包裝及生成,轉(zhuǎn)染72h后收集病毒液進行純化濃縮。將濃縮的病毒液用腦立體定位儀和微量注射泵定點注射到小鼠的DH腦區(qū)。然后用組織免疫熒光(immunofluorescence,IF)方法檢測病毒的侵染效率,用WB檢測HDAC7的干擾和過表達效率。2.2 干擾或過表達HDAC7對小鼠環(huán)境依賴恐懼記憶的影響用病毒在小鼠DH腦區(qū)干擾或者過表達HDAC7,然后進行CFC訓練。分別在訓練后1h和24h進行CFC測試,將經(jīng)過CFC訓練的小鼠放回訓練箱5min,不給足底電擊,記錄小鼠的不動(freezing)時間。檢測小鼠的短時記憶(short term memory,STM)和長時記憶(long term memory,LTM)。2.3 HDAC7作用的特異性用病毒在小鼠AMY腦區(qū)干擾或者過表達HDAC7,然后進行CFC訓練。分別在訓練后1h和24h進行CFC測試,將經(jīng)過CFC訓練的小鼠放回訓練箱5min,不給足底電擊,記錄小鼠的不動(freezing)時間。檢測小鼠的短時記憶(short term memory,STM)和長時記憶(long term memory,LTM)。3.HDAC7在不同海馬依賴的學習記憶模式中的作用用病毒裝載干擾或者過表達HDAC7的質(zhì)粒,在小鼠DH腦區(qū)干擾或者過表達HDAC7。用水迷宮檢測HDAC7對空間記憶的影響,采用一個直徑為120cm,高度40cm的圓柱形水池。水溫恒定在22℃C,在水池周圍布置不同的裝飾物作為觀察標記。將水池平分為四個象限,在其中一個象限中央放置一個隱藏的平臺。將小鼠面向池壁放入水中,使其自由游泳尋找平臺,連續(xù)訓練5天,第6天進行測試。用Smart軟件記錄小鼠的軌跡和找到平臺的潛伏期。檢測小鼠的空間學習記憶能力。用方位認知模型檢測HDAC7對小鼠方位認知的影響。在長*寬*高為40cm*40cm*35cm的立方體空間內(nèi),放入兩個相同的物體,讓小鼠進行自由探索訓練,24h后移動其中一個物體的位置,讓經(jīng)過探索訓練的小鼠再次自由探索。用Smart軟件記錄小鼠的軌跡和對不同位置物體的探索時間。檢測小鼠的方位認知能力。4.HDAC7生理變化的機制4.1 HDAC7蛋白合成和降解的檢測將小鼠進行埋管手術(shù),恢復兩周后進行CFC訓練。CFC訓練前分別將溶劑對照,蛋白合成抑制劑CHX和蛋白降解抑制劑βLAC通過微管注射到小鼠DH腦區(qū)。然后進行CFC訓練,訓練后6h處死小鼠,斷頭取材。用WB的方法檢測HDAC7蛋白水平的變化。用Co-IP的方法檢測HDAC7的泛素化的變化。4.2 HDAC7的E3連接酶的篩選及驗證用蛋白質(zhì)譜篩選HDAC7的E3連接酶。用外源Co-IP,內(nèi)源Co-IP,純化蛋白直接結(jié)合以及體外泛素化的方法驗證HDAC7的E3連接酶。4.3 E3連接酶對HDAC7參與環(huán)境依賴恐懼記憶的影響用病毒裝載CBX4的干擾序列。采用定點注射的方法,用立體定位儀和微量注射泵在小鼠DH腦區(qū)注射病毒。然后將小鼠進行CFC訓練及測試。記錄小鼠的freezing值。5.HDAC7影響環(huán)境依賴恐懼記憶的機制5.1 HDAC7調(diào)控的組蛋白乙�；稽c的篩選用病毒干擾小鼠DH腦區(qū)中的HDAC7,然后進行CFC訓練。6h后處死小鼠,斷頭取材,用WB的方法檢測不同乙�；稽c的變化。5.2 HDAC7調(diào)控的下游靶基因及其調(diào)控機制將小鼠進行CFC訓練,在不同時間點取材。用Real-time RT-PCR方法檢測Nur77的變化。在體外神經(jīng)元和小鼠DH腦區(qū)中分別用病毒干擾或者過表達HDAC7,然后用WB的方法檢測Nur77的變化。用染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay,CHIP)的方法檢測 HDAC7 對 Nur77 promoter的影響。5.3 HDAC7下游靶基因?qū)Νh(huán)境依賴恐懼記憶的影響用病毒裝載Nur77的干擾序列。在小鼠DH腦區(qū)定點注射干擾Nur77的病毒。然后進行CFC訓練及測試,記錄小鼠的freezing值。研究結(jié)果1.HDAC7在環(huán)境依賴恐懼記憶形成過程中的表達變化1.1 HDAC7在環(huán)境依賴恐懼記憶形成過程中蛋白水平明顯降低WB檢測小鼠DH腦區(qū)HDAC7的表達。結(jié)果顯示,在CFC訓練4h后HDAC7蛋白水平與正常對照(naive)組比較有顯著降低,到6h后降到最低,并能持續(xù)到24h。這一結(jié)果在IHC結(jié)果中也得到了驗證。1.2 HDAC7蛋白水平在背側(cè)海馬腦區(qū)特異性的降低WB檢測小鼠不同腦區(qū)中HDAC7在CFC訓練后蛋白水平的變化。結(jié)果顯示,與對照組相比,只有DH腦區(qū)中HDAC7蛋白水平降低,VH和AMY腦區(qū)中HDAC7的蛋白水平?jīng)]有明顯變化。WB檢測不同HDACs在CFC訓練后的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對naive相比,HDAC7蛋白水平明顯降低。1.3 環(huán)境及恐懼記憶的偶聯(lián)促進HDAC7的變化WB檢測不同刺激對HDAC7蛋白水平的影響。結(jié)果顯示,與naive組相比,單因素刺激(context,shock)組HDAC7沒明顯變化,CFC訓練組HDAC7蛋白水平明顯降低。2.背側(cè)海馬內(nèi)HDAC7損傷環(huán)境依賴恐懼記憶形成2.1 背側(cè)海馬內(nèi)HDAC7可以調(diào)控環(huán)境依賴恐懼記憶形成用病毒分別裝載HDAC7過表達質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒以及相應的對照質(zhì)粒,在小鼠DH腦區(qū)定點注射,然后進行CFC訓練和測試,記錄小鼠的Freezing值。結(jié)果顯示,與對照病毒組比較,過表達或干擾HDAC7組的小鼠在訓練和STM測試的Freezing值均沒有顯著變化,但是在LTM測試中,過表達HDAC7小鼠的Freezing值較對照組有顯著的下降。而干擾HDAC7小鼠的Freezing值較對照組有顯著的升高。2.2 在杏仁核腦區(qū)HDAC7不影響環(huán)境依賴恐懼記憶形成用病毒分別裝載HDAC7過表達質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒以及相應的對照質(zhì)粒,在小鼠AMY腦區(qū)定點注射,然后進行CFC訓練和測試,記錄小鼠的Freezing值。結(jié)果顯示,與對照病毒組比較,干擾HDAC7或者過表達HDAC7組的小鼠在訓練、STM和LTM測試中的Freezing值均沒有顯著變化。3.HDAC7參與多種海馬依賴的學習記憶范式3.1 干擾HDAC7促進小鼠空間記憶及方位認知能力在小鼠DH腦區(qū)干擾HDAC7,然后進行水迷宮訓練及測試。結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾HDAC7組的小鼠與對照組相比,找到平臺的潛伏期明顯降低;進行方位認知訓練及測試。結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾HDAC7組的小鼠與對照組相比,探索新位置物體的時間明顯增加。3.2 過表達HDAC7損傷小鼠空間記憶及方位認知能力在小鼠DH腦區(qū)過表達HDAC7,然后進行水迷宮訓練及測試。結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達HDAC7組的小鼠與對照組相比,找到平臺的潛伏期明顯增加;進行方位認知訓練及測試。結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達HDAC7組的小鼠與對照組相比,探索新位置物體的時間明顯減少。4.HDAC7在環(huán)境依賴恐懼記憶形成過程中通過泛素化降解4.1 HDAC7在環(huán)境依賴恐懼記憶形成過程中泛素化增加Real-time RT-PCR檢測CFC對DH腦區(qū)中HDAC7的mRNA水平的影響并發(fā)現(xiàn),與naive組相比,CFC后各個時間點小鼠DH腦區(qū)中HDAC7的mRNA水平?jīng)]有明顯改變。用內(nèi)源Co-IP檢測CFC后HDAC7的泛素化的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),CFC組較對照組泛素化水平明顯增加。用腦內(nèi)埋管技術(shù),在小鼠DH腦區(qū)中微量注射蛋白合成抑制劑CHX,蛋白降解抑制劑βLAC和溶劑對照,然后進行CFC訓練。用WB檢測HDAC7蛋白水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),βLAC組HDAC7與對照組相比沒有明顯差異,CHX組HDAC7蛋白水平較對照組明顯降低。4.2 CBX4作為HDAC7的E3連接酶促進HDAC7的泛素化降解用質(zhì)譜的方法篩選HDAC7的E3連接酶,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CBX4是HDAC7緊密結(jié)合的E3連接酶。用內(nèi)源Co-IP,外源Co-IP以及體外純化蛋白Co-IP檢測HDAC7和CBX4的結(jié)合。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HDAC7和CBX4有明顯的結(jié)合。用內(nèi)源Co-IP及體外泛素化實驗檢測CBX4對HDAC7泛素化的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾CBX4組HDAC7泛素化較正常組明顯減少。4.3 CBX4在環(huán)境依賴恐懼記憶形成過程表達增加用WB檢測CBX4在CFC過程中的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與naive相比,CBX4在CFC后表達明顯增加。用WB檢測干擾CBX4后HDAC7的表達變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾CBX4組與對照組相比HDAC7的表達明顯增加。4.4 干擾CBX4可以損傷環(huán)境依賴恐懼記憶形成用病毒裝載CBX4的干擾質(zhì)粒,定點注射在小鼠DH腦區(qū),然后進行CFC訓練,記錄小鼠freezing值。結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾CBX4組小鼠的freezing值較對照組明顯降低。并且同時干擾Nur77和HDAC7組小鼠的Freezing值較單獨干擾CBX4組有顯著升高。5.HDAC7通過Nur77發(fā)揮調(diào)控環(huán)境依賴恐懼記憶的形成5.1 Nur77在環(huán)境依賴恐懼記憶形成過程表達增加用Real-time RT-PCR和WB檢測CFC后Nur77的表達變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與naiive組相比,CFC訓練能促進DH腦區(qū)中Nur77的表達,但是VH腦區(qū)中Nur77沒有明顯變化。5.2 HDAC7通過抑制H4K12位點的乙�；{(diào)控Nur77的表達用WB和CHIP的方法檢測HDAC7對Nur77的調(diào)控機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,干擾HDAC7組H4K12位點的乙�；矫黠@增加,Nur77 promoter表達顯著升高,Nur77蛋白水平較對照組有明顯的升高。5.3 干擾Nur77損傷環(huán)境依賴恐懼記憶形成,并且能一定程度的逆轉(zhuǎn)HDAC7的作用用病毒裝載Nur77的干擾質(zhì)粒,在小鼠DH腦區(qū)定點注射病毒干擾Nur77表達,然后進行CFC訓練及測試,記錄小鼠Freezing值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)和對照組相比較,單獨干擾Nur77組小鼠的Freezing值明顯降低,并且同時干擾Nur77和HDAC7組小鼠的Freezing較對照組也明顯降低。研究結(jié)論與創(chuàng)新性1.本研究首次闡明了 HDAC7在海馬依賴的學習記憶中的表達變化及其調(diào)控機制,發(fā)現(xiàn)在CFC聯(lián)想學習記憶過程中HDAC7表達明顯降低,過表達HDAC7損傷海馬依賴的學習記憶,CFC記憶形成過程中E3連接酶CBX4參與了HDAC7的降解。2.本研究進一步闡明HDAC7調(diào)控海馬依賴學習記憶的作用機制,發(fā)現(xiàn)HDAC7通過調(diào)控H4K12位點乙�；{(diào)控下游基因Nur77的表達,從而影響海馬依賴的學習記憶。綜上,本研究發(fā)現(xiàn)HDAC7通路調(diào)控海馬依賴學習記憶的多個靶點,包括:CBX4,HDAC7和Nur77,為治療臨床上以學習記憶能力異常為主要特征的疾病提供了重要的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R749
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本文編號：1573747