本文選題：miR-454　切入點：結直腸癌　出處：《山東大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景及意義結直腸癌(colorectal cancer, CRC)是常見的發(fā)生于結腸部位的消化道惡性腫瘤,好發(fā)于直腸與乙狀結腸交界處,以40～50歲年齡組發(fā)病率最高,男女之比為2-3：1。結直腸癌是男性第三常見的腫瘤,女性第二常見的腫瘤。結直腸癌的癥狀和體征取決于腫瘤在腸道內位置以及腫瘤在體內擴展的情況。早期結直腸癌診斷困難,因為其沒有癥狀或癥狀不明顯,隨著腫瘤的進展,其癥狀和體征逐漸出現(xiàn)。常見的報警癥狀有：頑固的便秘、大便潛血、大便變細、食欲不振及體重下降等等。當50歲以上的人出現(xiàn)便血及貧血時,更應被列為高風險特征。結直腸癌主要分為三個類型,分別為腺癌、黏液腺癌、未分化癌。腫瘤的形態(tài)大體呈息肉狀、潰瘍型等。結腸腫瘤可沿腸壁環(huán)行發(fā)展,沿腸管縱徑上下蔓延或向腸壁深層浸潤,除經淋巴管、血流轉移和局部侵犯外,還可向腹腔內種植或沿縫線、切口面擴散轉移。慢性結腸炎患者、結腸息肉患者、男性肥胖者等為易感人群。對可進行手術的患者而言,手術是最常用的治療手段,其次是化學療法、放射療法、生物療法及中醫(yī)中藥等治療。然而,術后腫瘤的復發(fā)和癌細胞的轉移是非常常見的。因此,目前迫切需要找到結直腸癌發(fā)病的潛在分子機制,進而發(fā)現(xiàn)治療這種疾病的分子靶點。近期,真核生物內生性的,非編碼的小RNA(19-22個核酸)microRNAs (miRNAs)被發(fā)現(xiàn)能夠通過與3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)的不完全雜交弱化甚至終止mRNA的翻譯。在幾種具有調控細胞增殖功能的miRNA中,miR-454被證實是數種癌癥的腫瘤細胞增殖的重要決定性因素。在此之后,有許多miR-454作用的靶基因被發(fā)現(xiàn)。在這些靶基因中,腫瘤抑制因子(CYLD)已被證實與癌細胞凋亡有關。細胞增殖,作為腫瘤的最重要特征,是惡性腫瘤,尤其是結直腸癌的最主要致死因素。但到目前為止,結直腸癌與miR-454表達間的關系還未被闡明。在本研究中,我們報道了結直腸癌中miR-454與結直腸癌細胞的增殖有關。更多研究表明miR-454可以通過直接作用于CYLD基因的3'-UTR來抑制其表達,進而促進結直腸癌細胞的增殖。由此我們做出推斷,以miR-454為分子靶點對結直腸癌進行治療,可能是針對結直腸癌新的、有效的治療方法。本研究分為五個部分進行闡述。實驗一研究目的：檢測結直腸癌組織中miR-454的表達水平。研究方法：經八位結直腸癌患者同意獲得其人結直腸癌組織以及相應癌旁組織(TAT),用qRT-PCR評估檢測結直腸癌組織、癌旁組織的miR-454表達水平。另外,選用人類CRC細胞株SW403, HT-29, COL0320DM, COL0205, SW480, KM202L, SW620和正常結腸細胞FHC,共八種細胞系,同樣用qRT-PCR評估檢測其miR-454表達水平。研究結果：從各qRT-PCR所得結果可以看到,與癌旁組織相比CRC組織中miR-454的表達水平明顯上調,差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P0.01)。并且所有7個測試的結直腸癌細胞系的miR-454表達水平均高于正常結腸細胞系FHC。這些結果表明,可以認為miR-454在結直腸癌發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。同時,這些結果表明,miR-454在結直腸癌組織中的表達顯著增加,提示miR-454可作為結直腸癌患者的預后指標。研究結論：miR-454在結直腸癌組織和結直腸癌細胞系中的表達顯著,說明miR-454基因對結直腸癌發(fā)病有重要意義。實驗二研究目的：研究miR-454基因對結直腸癌細胞增殖的促進作用研究方法：以脂質體為載體,將mir-454mimics,以及作為控制組的miR-454抑制基因miR-454 inhibitor (miR-454-in)轉染SW480細胞,并通過qRT-PCR評估轉染后兩種細胞的miR-454水平,驗證轉染成功。使用兩種細胞進行MTT、平板克隆形成,非錨定獨立生長實驗,分析miR-454對結直腸癌細胞增殖能力的影響。研究結果：MTT法的結果顯示,miR-454 mimics的轉染顯著增加了SW480細胞的增殖率,而集落形成實驗進一步證實了這一點。引人注目的是,我們發(fā)現(xiàn),miR-454的表達大大增強了SW480細胞的錨地獨立生長能力。相反,轉染了miR-454 inhibitor (miR-454-in)的SW480細胞的細胞增長率和集落數與轉染了miR-454 mimics的SW480細胞相比顯著降低。此外,轉染了miR-454 inhibitor (miR-454-in)的SW480細胞的錨地獨立生長能力顯著下降。這些結果表明,在體外環(huán)境下,miR-454提高了結直腸癌細胞的致瘤性。研究結論：miR-454基因能夠顯著促進結直腸癌細胞增殖活動。實驗三研究目的：研究miR-454對CYLD表達水平的影響研究方法：人們普遍認為miRNA通過調節(jié)下游靶基因的表達來發(fā)揮它們的功能。利用生物信息學方法,我們預測了miR-454的潛在作用目標：CYLD。這個含有一處miR-454結合部位的腫瘤抑制基因,被選定進行進一步的分析。為了確定miR-454是否影響了CYLD的表達,我們選用miR-454 mimics, miR-454 inhibitor (miR-454-in)轉染的SW480細胞和正常SW480細胞進行CYLD表達的檢測。檢測手段包括用western blot分析三種細胞CYLD蛋白分泌水平；再將miR-454 mimics轉染至具有CYLD3'-UTR突變基因的SW480細胞,將這種細胞通過熒光素酶活性測定法與miR-454 mimics, miR-454 inhibitor轉染的SW480細胞和正常SW480細胞比較CYLD基因表達情況,驗證miR-454與CYLD基因的結合位點。研究結果：western blot分析結果表明,miR-454 mimics顯著抑制了SW480細胞的CYLD蛋白水平,而miR-454-in明顯促進了CYLD蛋白的表達。熒光素酶活性測定實驗顯示,在miR-454 mimics轉染的SW480細胞中可以觀察到熒光素酶活性減少,而且其減少幅度與轉染的量呈線性相關,然而在miR-454-in轉染的SW480細胞中因為對miR-454受到抑制而使CYLD基因的熒光素酶活性增加。同時,轉染進入的miR-454基因對3’-UTR突變型SW480細胞的熒光素酶活性沒有影響。將得到這幾個結果綜合來看,可以確定CYLD是miR-454的目的基因,3’-UTR是miR-454的作用位點。研究結論：MiR-454通過結合3’-UTR直接與CYLD結合,降低其表達水平。實驗四研究目的：miR-454對有關癌細胞增殖的其他基因的影響研究方法：以上的結果已經表明,mir-454能促進CRC細胞的生長和增殖,CYLD是miR-454的直接目標。之前的報道的研究表明CYLD與細胞增殖密切相關。我們對兩種關鍵的細胞增殖調控因子c-Myc以及cyclin Dl蛋白的表達水平也進行了檢測。c-Myc基因是一個核轉錄因子,其靶基因對細胞增殖、分化、細胞凋亡和其他細胞功能有重要作用,細胞周期蛋白cyclin D1也屬于被c-Myc基因調控之列。我們通過western blot的方法檢測c-Myc基因和cyclin D1蛋白在對照SW480細胞,轉染miR-454 mimics和miR-454-in的SW480細胞的表達調控。研究結果：western blot檢測結果表明,相對于對照細胞,cyclin D1和c-myc的表達在轉染miR-454mimics的SW480細胞中上調,但在轉染miR-454-in的SW480細胞中降低。這些結果提供了進一步的證據證明miR-454對CRC細胞增殖的起到重要作用。研究結論：總而言之,我們的研究結果表明,miR-454調節(jié)了細胞增殖的調控因子cyclin D1和c-myc基因,進而對細胞增殖產生相關作用。實驗五研究目的：miR-454抑制CYLD表達與其促進癌細胞增殖的關系研究方法：為了進一步研究CYLD的減少在miR-454增強CRC細胞增殖中的作用,我們首先研究了CYLD下調對CRC細胞增殖的影響。我們將CYLD的兩種siRNA (Small interfering RNA):CYLD-siRNA#1和CYLD-siRNA#2轉染入已先期轉染miR-454-in的SW480細胞系中,用免疫印跡分析(western blot)檢測CYLD在相應SW480細胞系中的表達,利用平板克隆形成,錨定非依賴生長分析檢測相應SW480細胞系的增殖情況。研究結果：免疫印跡分析表明, CYLD-siRNA#1和CYLD-siRNA#2均能有效降低CYLD在轉染了mir-454-in的SW480細胞中的表達,形成了CYLD沉默。平板克隆形成,錨定非依賴生長分析顯示在轉染了mir-454-in的SW480細胞中的CYLD沉默對細胞增殖中起到加強作用�？偠灾�,這些結果證實,直接的CYLD表達下調是是miR-454誘導CRC細胞增殖的必要條件。研究結論：CYLD的抑制是miR-454誘導CRC細胞增殖的必要條件
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34

【參考文獻】

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1 梁燕華,楊森,張學軍;多發(fā)性家族性毛發(fā)上皮瘤的臨床和遺傳特征分析[J];食品與藥品;2005年11期

2 ;The effect of C-terminal fragment of JNK2 on the stability of p53 and cell proliferation[J];Cell Research;2004年05期

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本文編號：1566208