發(fā)布時(shí)間：2018-02-25 03:26

  本文關(guān)鍵詞： 肺腺癌 小凹蛋白 表皮生長(zhǎng)因子受體 酪氨酸激酶抑制劑 藥物敏感性 耐藥　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率一直位居首位的惡性腫瘤。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占所有肺癌總數(shù)的85%左右,而肺腺癌是其中最常見的病理類型。盡管肺癌的早期檢測(cè)有了巨大的提升,但大部分患者被確診時(shí)已屬于肺癌晚期,從而導(dǎo)致預(yù)后不良。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)在40%-80%的NSCLC中呈現(xiàn)過表達(dá),其同源或異源二聚體化和自身磷酸化都會(huì)激活下游的MAPK和PI3K信號(hào)通路,從而引起細(xì)胞過度生長(zhǎng),生存和轉(zhuǎn)移。以EGFR為靶點(diǎn)的酪氨酸激酶抑制劑(tyrosin kinase inhibitors,TKIs)可通過與ATP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合EGFR酪氨酸激酶域從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此,EGFR-TKIs已成為EGFR突變陽(yáng)性的肺腺癌治療的有效手段。且有研究證實(shí)腫瘤細(xì)胞中EGFR-TKIs的敏感性和EGFR基因的突變類型相關(guān),其敏感突變?yōu)?9外顯子缺失突變(delE746-A750)、18外顯子點(diǎn)突變(L858R)和21外顯子點(diǎn)突變(G719S)。因此,EGFR-TKIs已成為EGFR敏感突變型晚期NSCLC患者的一線用藥方案。然而,EGFR-TKIs療效存在明顯的個(gè)體差異,約25%帶有EGFR敏感突變類型的患者對(duì)EGFR-TKIs不敏感或治療無反應(yīng),即發(fā)生原發(fā)耐藥。而且即使對(duì)EGFR-TKIs治療起初有效的患者,其臨床療效也不盡一致,且最終都不可避免的出現(xiàn)獲得性耐藥。雖然針對(duì)EGFR突變本身(T790M)、EGFR通路相關(guān)分子(c-MET擴(kuò)增)以及其他通路分子的研究已部分證實(shí)均和EGFR-TKIs耐藥有關(guān),但尚不足解釋EGFR-TKIs在EGFR基因突變肺腺癌患者中的療效差異。小凹蛋白(Caveolin-1,Cav-1)是細(xì)胞質(zhì)膜表面特異性膜內(nèi)陷囊泡的重要標(biāo)志性結(jié)構(gòu)蛋白,分子量21-24kDa。Cav-1可以通過其微囊中的腳手架結(jié)合域和許多信號(hào)蛋白結(jié)合(EGFR、ErbB2、H-Ras、MEK等)從而影響和調(diào)控其下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞一系列生物學(xué)行為的改變。許多研究證實(shí)Cav-1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。我們的前期實(shí)驗(yàn)也已證實(shí),在肺腺癌細(xì)胞中,Cav-1通過影響EGFR的磷酸化調(diào)節(jié)其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),從而影響肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等能力。另外,有研究顯示cav-1與腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥和對(duì)化療藥的敏感性有關(guān),且在許多耐藥的腫瘤細(xì)胞中cav-1呈現(xiàn)高表達(dá)。但目前為止關(guān)于cav-1是否影響分子靶向藥的敏感性尚未見報(bào)道。本研究通過臨床結(jié)合細(xì)胞學(xué)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究以期明確(1)cav-1表達(dá)量是否與肺腺癌對(duì)egfr-tkis的敏感性有關(guān)。(2)cav-1影響肺腺癌egfr-tkis敏感性的分子機(jī)制。為臨床解釋egfr-tkis療效的個(gè)體差異提供可能的理論依據(jù),為臨床精準(zhǔn)選擇egfr-tkis藥物提供新的生物標(biāo)記物,為臨床研發(fā)克服egfr-tkis耐藥的新藥提供新靶點(diǎn)。第一部分caveolin-1在egfr突變陽(yáng)性晚期肺腺癌組織中的表達(dá)及其與吉非替尼療效的相關(guān)性研究目的:明確cav-1在egfr突變陽(yáng)性晚期肺腺癌組織中的表達(dá)以及探討其與吉非替尼療效的相關(guān)性。方法:1臨床標(biāo)本選取中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院2011年7月-2014年7月收治的接受吉非替尼一線治療的egfr突變陽(yáng)性(19外顯子缺失突變)的晚期(iiib或iv期)肺腺癌患者標(biāo)本20例。近期療效評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)按照實(shí)體腫瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(responseevaluationcriteriainsolidtumors,recist1.1),分為完全緩解(completeresponse,cr)、部分緩解(partialresponse,pr)、疾病穩(wěn)定(stabledisease,sd)和疾病進(jìn)展(progressivedisease,pd)。遠(yuǎn)期療效為無疾病進(jìn)展時(shí)間(progressionfreesurvival,pfs)和總生存期(overallsurvival,os)。2免疫組化將福爾馬林固定、石蠟包埋的蠟塊制成5μm的連續(xù)切片,孵育cav-1和ki-67抗體后進(jìn)行免疫染色。免疫組化的結(jié)果由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理科大夫利用雙盲法進(jìn)行評(píng)分。采用h指數(shù)分析cav-1表達(dá)情況可綜合考慮染色強(qiáng)度和密度,其中染色強(qiáng)度分為0-3四個(gè)等級(jí);染色密度有低至高分別記為0-100。最終h指數(shù)由以下公式計(jì)算得出:h指數(shù)=(染色強(qiáng)度為1細(xì)胞面積%×1)+(染色強(qiáng)度為2細(xì)胞面積%×2)+(染色強(qiáng)度為3細(xì)胞面積%×3)。ki-67陽(yáng)性信號(hào)為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色細(xì)小顆粒,計(jì)數(shù)500個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比來計(jì)算平均陽(yáng)性率。結(jié)果:1cav-1在肺腺癌組織中的表達(dá)光鏡下觀察cav-1染色情況,可見其分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿,而ki-67分布于細(xì)胞核。通過h評(píng)分和線性相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)在肺腺癌組織中,cav-1表達(dá)與ki-67表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.71;p0.05)。2高表達(dá)cav-1預(yù)示吉非替尼療效不佳及pfs較短根據(jù)患者的病理特征分組分析發(fā)現(xiàn),這些病理特征與cav-1的表達(dá)水平并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),但根據(jù)吉非替尼治療的疾病反應(yīng)率、pfs和os分組的分析發(fā)現(xiàn),其與cav-1的表達(dá)水平均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。經(jīng)吉非替尼治療后,所有患者的總緩解率達(dá)60%,且(cr+pr)組的病人中cav-1的評(píng)分明顯低于(sd+pd)組。此外,所有患者的中位pfs為8個(gè)月(95%ci:6.910-9.090),且患者pfs較短的分組中cav-1的評(píng)分明顯高于pfs較長(zhǎng)組;所有患者的中位os為16.5個(gè)月(95%ci:13.578-19.422),且患者os較短的分組中cav-1的評(píng)分明顯高于os較長(zhǎng)組。以所有患者組織標(biāo)本中cav-1評(píng)分的中位數(shù)為截?cái)嘀?將患者分為cav-1高表達(dá)組和低表達(dá)組。通過分析發(fā)現(xiàn),cav-1高表達(dá)組中患者的總緩解率明顯低于cav-1低表達(dá)組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);cav-1高表達(dá)組中患者的pfs明顯短于cav-1低表達(dá)組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);而兩組間的os并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。第二部分敲低caveolin-1的表達(dá)對(duì)egfr突變陽(yáng)性肺腺癌細(xì)胞egfr-tkis敏感性的影響目的:探討敲低cav-1的表達(dá)對(duì)egfr突變陽(yáng)性肺腺癌細(xì)胞egfr-tkis敏感性的影響。方法:1細(xì)胞轉(zhuǎn)染選取對(duì)egfr-tkis敏感的中量表達(dá)cav-1的pc-9細(xì)胞,分別轉(zhuǎn)染controlshrna或cav-1shrna質(zhì)粒,嘌呤霉素進(jìn)行抗性篩選,構(gòu)建正常表達(dá)cav-1的pc-9/ctrl和低表達(dá)cav-1的pc-9/kd細(xì)胞。2增殖抑制實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞接種于96孔板,過夜貼壁后分別用不同濃度的egfr-tkis(吉非替尼和厄洛替尼)處理,培養(yǎng)一定的時(shí)間后上機(jī)檢測(cè)吸光度值(od)。半數(shù)抑制濃度(halfmaximalinhibitoryconcentration,ic50)定義為細(xì)胞抑制達(dá)50%時(shí)的藥物濃度。而后,以每對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中較低的ic50來處理細(xì)胞,檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72h)的細(xì)胞抑制率。3克隆形成實(shí)驗(yàn)克隆形成實(shí)驗(yàn)是以一種細(xì)胞不相互接觸的方式來檢測(cè)細(xì)胞增殖快慢的實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞以低密度接種,300個(gè)/培養(yǎng)皿,在有或無egfr-tkis的環(huán)境中培養(yǎng),8-12天后可觀察到肉眼可見的克隆,蘇木素染色后進(jìn)行計(jì)數(shù)。4劃痕實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞接種于24孔板,過夜貼壁后形成單細(xì)胞層,移液器槍頭進(jìn)行劃痕,在有或無egfr-tkis的環(huán)境中培養(yǎng),不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行拍照直到劃痕愈合。5侵襲實(shí)驗(yàn)將稀釋后的基質(zhì)膠鋪于小室的上室,當(dāng)膠凝固后加入有或無egfr-tkis處理的細(xì)胞,下室加入適量完全1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后,將穿膜的細(xì)胞進(jìn)行he染色,顯微鏡下拍照和計(jì)數(shù)。6蛋白印跡將有或無egfr-tkis處理的細(xì)胞裂解和定量后,10%sds-page分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉或3%牛血清白蛋白封閉、一抗4℃過夜孵育、二抗常溫孵育1h,最后ecl試劑盒進(jìn)行顯色。7免疫共沉淀將裂解后的細(xì)胞蛋白分別用抗egfr和抗cav-1的抗體進(jìn)行免疫沉淀,4℃過夜孵育。然后在每管樣品中加入40ml蛋白g瓊脂糖微珠,4℃滾動(dòng)混勻2h。蛋白印跡分別檢測(cè)蛋白裂解液和免疫沉淀復(fù)合物中egfr和cav-1蛋白的表達(dá)。8激光共聚焦將細(xì)胞接種到提前置入蓋玻片的培養(yǎng)皿中,4%多聚甲醛固定20min,0.1%tritonx-100透化10min,8%bsa封閉1h,抗cav-1和抗egfr抗體同時(shí)加到載玻片上4℃過夜孵育,熒光二抗alexaflour488羊抗鼠igg和alexaflour555羊抗兔igg同時(shí)加到載玻片上37℃避光孵育1h。dapi染核室溫避光孵育5min。激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況并拍照9體內(nèi)實(shí)驗(yàn)5周齡裸鼠右背部皮下接種細(xì)胞,每周測(cè)量瘤徑,計(jì)算腫瘤體積:瘤體積=1/2×長(zhǎng)徑×短徑2。當(dāng)瘤體積達(dá)40mm3時(shí),將各組裸鼠分別分為加藥組(吉非替尼6mg/kg)和不加藥組(相同體積的滅菌水)。灌胃4周后脫頸處死裸鼠,稱量瘤重并計(jì)算抑瘤率。每只裸鼠的瘤組織用于后續(xù)蛋白印跡和免疫組織化學(xué)結(jié)果:1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建pc-9/kd細(xì)胞中cav-1的相對(duì)表達(dá)量明顯低于pc-9親本株和pc-9/ctrl細(xì)胞,差異均有顯著性(p0.05)。結(jié)果證實(shí):敲低cav-1表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建成功。2敲低cav-1的表達(dá)增強(qiáng)pc-9細(xì)胞對(duì)egfr-tkis的敏感性mts法檢測(cè)cav-1表達(dá)對(duì)pc-9細(xì)胞egfr-tkis敏感性的影響,結(jié)果顯示:在不同濃度egfr-tkis作用時(shí),無論吉非替尼還是厄洛替尼,pc-9/kd細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率明顯高于pc-9/ctrl細(xì)胞,差異均有顯著性(p0.05),且隨濃度的遞增,細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率也增加。pc-9/kd細(xì)胞的ic50值明顯低于pc-9/ctrl細(xì)胞,差異均有顯著性(p0.05)。在不同時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72h)作用下,pc-9/kd細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率同樣明顯高于pc-9/ctrl細(xì)胞,差異均有顯著性(p0.05),且隨著時(shí)間點(diǎn)的延長(zhǎng),細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率也增加。結(jié)果證實(shí):egfr-tkis對(duì)pc-9的抑制作用具有時(shí)效性和量效性;敲低cav-1表達(dá)增強(qiáng)pc-9細(xì)胞對(duì)egfr-tkis的敏感性。3敲低cav-1的表達(dá)抑制pc-9細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,增強(qiáng)egfr-tkis對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的抑制效應(yīng)無egfr-tkis作用時(shí),pc-9/kd細(xì)胞的克隆形成率明顯低于pc-9/ctrl細(xì)胞,差異均有顯著性(p0.05)。在egfr-tkis作用時(shí),無論吉非替尼還是厄洛替尼,egfr-tkis對(duì)pc-9/kd細(xì)胞克隆形成的抑制效應(yīng)明顯強(qiáng)于pc-9/ctrl細(xì)胞,差異均有顯著性(p0.05)。無egfr-tkis作用時(shí),pc-9/kd細(xì)胞的劃痕愈合時(shí)間明顯長(zhǎng)于pc-9/ctrl細(xì)胞,差異均有顯著性(p0.05)。在egfr-tkis作用時(shí),無論吉非替尼還是厄洛替尼,egfr-tkis對(duì)pc-9/kd細(xì)胞劃痕愈合的抑制效應(yīng)明顯強(qiáng)于pc-9/ctrl細(xì)胞,差異均有顯著性(p0.05)。無egfr-tkis作用時(shí),pc-9/kd細(xì)胞的穿膜數(shù)明顯少于pc-9/ctrl細(xì)胞,差異均有顯著性(p0.05)。在egfr-tkis作用時(shí),無論吉非替尼還是厄洛替尼,egfr-tkis對(duì)pc-9/kd細(xì)胞侵襲能力的抑制效應(yīng)明顯強(qiáng)于pc-9/ctrl細(xì)胞,差異均有顯著性(p0.05)。結(jié)果證實(shí):敲低cav-1表達(dá)抑制pc-9細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,增強(qiáng)egfr-tkis對(duì)其抑制的效應(yīng)。4敲低cav-1的表達(dá)通過抑制egfr的活化增強(qiáng)pc-9細(xì)胞對(duì)egfr-tkis的敏感性無egfr-tkis作用時(shí),pc-9/kd細(xì)胞中p-egfr、p-akt、p-erk的相對(duì)水平明顯低于pc-9/ctrl細(xì)胞,差異均有顯著性(p0.05)。在有egfr-tkis作用時(shí),無論吉非替尼還是厄洛替尼,egfr-tkis對(duì)pc-9/kd細(xì)胞中p-egfr、p-akt、p-erk表達(dá)水平的抑制效應(yīng)明顯強(qiáng)于pc-9/ctrl細(xì)胞,差異均有顯著性(p0.05)。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)cav-1和egfr可以直接結(jié)合。激光共聚焦顯微鏡下觀察到細(xì)胞膜和細(xì)胞漿處紅色區(qū)域代表cav-1表達(dá),綠色區(qū)域代表egfr表達(dá),將兩者merge后的黃色代表cav-1和egfr共定位。結(jié)果證實(shí):敲低cav-1表達(dá)降低pc-9細(xì)胞中mapk和pi3k信號(hào)通路活化蛋白的表達(dá),增強(qiáng)egfr-tkis敏感性。5敲低cav-1的表達(dá)抑制裸鼠腫瘤組織的生長(zhǎng)pc-9/kd組裸鼠腫瘤體積明顯小于pc-9/ctrl組,差異均有顯著性(p0.05);pc-9/kd組裸鼠腫瘤重量明顯輕于pc-9/ctrl組,差異均有顯著性(p0.05)。6敲低cav-1的表達(dá)增強(qiáng)肺腺癌腫瘤組織對(duì)吉非替尼的敏感性在吉非替尼灌胃2周后,pc-9/kd組的裸鼠腫瘤體積開始縮小,而pc-9/ctrl組的裸鼠腫瘤體積呈緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì),差異均有顯著性(p0.05)。pc-9/kd組的抑瘤率明顯大于pc-9/ctrl組,差異均有顯著性(p0.05)。westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)cav-1表達(dá)對(duì)瘤組織中mapk和pi3k信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果同體外實(shí)驗(yàn)一致。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:pc-9/kd組中cav-1和ki-67的表達(dá)水平明顯低于pc-9/ctrl組;無吉非替尼作用時(shí),cav-1的表達(dá)水平與ki-67存在正相關(guān);有吉非替尼作用時(shí),ki-67的表達(dá)水平明顯下降。第三部分過表達(dá)caveolin-1對(duì)egfr突變陽(yáng)性肺腺癌細(xì)胞egfr-tkis敏感性的影響目的:探討過表達(dá)cav-1對(duì)egfr突變陽(yáng)性肺腺癌細(xì)胞egfr-tkis敏感性的影響。方法:1細(xì)胞轉(zhuǎn)染選取對(duì)egfr-tkis敏感的中量表達(dá)cav-1的pc-9細(xì)胞,分別轉(zhuǎn)染pcdna3.1或pcdna3.1/cav-1質(zhì)粒,g418進(jìn)行抗性篩選,構(gòu)建正常表達(dá)cav-1的pc-9/pcdna3.1和過表達(dá)cav-1的pc-9/cav-1細(xì)胞。2其余方法同第二部分。結(jié)果:1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建pc-9/cav-1細(xì)胞中cav-1的相對(duì)表達(dá)量明顯高于pc-9親本株和pc-9/pcdna3.1細(xì)胞,差異均有顯著性(p0.05)。結(jié)果證實(shí):過表達(dá)cav-1的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建成功。2過表達(dá)cav-1降低pc-9細(xì)胞對(duì)egfr-tkis的敏感性mts法檢測(cè)cav-1表達(dá)對(duì)pc-9細(xì)胞egfr-tkis敏感性的影響,結(jié)果顯示:在不同濃度egfr-tkis作用時(shí),無論吉非替尼還是厄洛替尼,pc-9/cav-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率明顯低于pc-9/pcdna3.1細(xì)胞,差異均有顯著性(p0.05),且隨濃度的遞增,細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率也增加。pc-9/cav-1細(xì)胞的ic50值明顯高于pc-9/pcdna3.1細(xì)胞,差異均有顯著性(p0.05)。在不同時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72h)作用下,pc-9/cav-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率同樣明顯低于pc-9/pcdna3.1細(xì)胞,差異均有顯著性(p0.05),且隨著時(shí)間點(diǎn)的延長(zhǎng),細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率也增加。結(jié)果證實(shí):egfr-tkis對(duì)pc-9的抑制作用具有時(shí)效性和量效性;過表達(dá)cav-1降低pc-9細(xì)胞對(duì)egfr-tkis的敏感性。3過表達(dá)cav-1促進(jìn)pc-9細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,降低egfr-tkis對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的抑制效應(yīng)無egfr-tkis作用時(shí),pc-9/cav-1細(xì)胞的克隆形成率明顯高于pc-9/pcdna3.1細(xì)胞,差異均具有顯著性(p0.05)。在egfr-tkis作用時(shí),無論吉非替尼還是厄洛替尼,egfr-tkis對(duì)pc-9/cav-1細(xì)胞克隆形成的抑制效應(yīng)明顯弱于pc-9/pcdna3.1細(xì)胞,差異均具有顯著性(p0.05)。無egfr-tkis作用時(shí),pc-9/cav-1細(xì)胞的劃痕愈合時(shí)間明顯短于pc-9/pcdna3.1細(xì)胞,差異均具有顯著性(p0.05)。在egfr-tkis作用時(shí),無論吉非替尼還是厄洛替尼,egfr-tkis對(duì)pc-9/cav-1細(xì)胞劃痕愈合的抑制效應(yīng)明顯弱于pc-9/pcdna3.1細(xì)胞,差異均具有顯著性(p0.05)。無egfr-tkis作用時(shí),pc-9/cav-1細(xì)胞的穿膜數(shù)明顯多于pc-9/pcdna3.1細(xì)胞,差異均具有顯著性(p0.05)。在egfr-tkis作用時(shí),無論吉非替尼還是厄洛替尼,egfr-tkis對(duì)pc-9/cav-1細(xì)胞侵襲能力的抑制效應(yīng)明顯弱于pc-9/pcdna3.1細(xì)胞,差異均具有顯著性(p0.05)。結(jié)果證實(shí):過表達(dá)cav-1可以增強(qiáng)pc-9細(xì)胞的生物學(xué)行為,減弱egfr-tkis對(duì)其抑制的效應(yīng)。4過表達(dá)cav-1通過調(diào)控egfr的活化降低pc-9細(xì)胞對(duì)egfr-tkis的敏感性無egfr-tkis作用時(shí),pc-9/cav-1細(xì)胞中p-egfr、p-akt、p-erk的相對(duì)水平明顯高于pc-9/pcdna3.1細(xì)胞,差異均有顯著性(p0.05)。在有egfr-tkis作用時(shí),無論吉非替尼還是厄洛替尼,egfr-tkis對(duì)pc-9/cav-1細(xì)胞中p-egfr、p-akt、p-erk表達(dá)水平的抑制效應(yīng)明顯弱于pc-9/pcdna3.1細(xì)胞,差異均有顯著性(p0.05)。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)cav-1和egfr可以直接結(jié)合。激光共聚焦顯微鏡下觀察到細(xì)胞膜和細(xì)胞漿處紅色區(qū)域代表cav-1表達(dá),綠色區(qū)域代表egfr表達(dá),將兩者merge后的黃色代表cav-1和egfr共定位。結(jié)果證實(shí):過表達(dá)cav-1促進(jìn)pc-9細(xì)胞中mapk和pi3k信號(hào)通路活化蛋白的表達(dá),減弱egfr-tkis敏感性。5過表達(dá)cav-1促進(jìn)裸鼠腫瘤組織的生長(zhǎng)pc-9/cav-1組裸鼠腫瘤體積明顯大于pc-9/pcdna3.1組,差異均有顯著性(p0.05);pc-9/cav-1組裸鼠腫瘤重量明顯重于pc-9/pcdna3.1組,差異均有顯著性(p0.05)。6過表達(dá)cav-1降低肺腺癌腫瘤組織對(duì)吉非替尼的敏感性在吉非替尼灌胃2周后,pc-9/cav-1組的裸鼠腫瘤體積呈緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì),而pc-9/pcdna3.1組的裸鼠腫瘤體積呈穩(wěn)定不變或緩慢縮小的趨勢(shì),差異均有顯著性(p0.05)。pc-9/cav-1組的抑瘤率明顯小于pc-9/pcdna3.1組,差異均有顯著性(p0.05)。westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)cav-1表達(dá)對(duì)瘤組織中mapk和pi3k信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果同體外實(shí)驗(yàn)一致。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:PC-9/Cav-1組中Cav-1和Ki-67的表達(dá)水平明顯高于PC-9/pcDNA3.1組;無吉非替尼作用時(shí),Cav-1的表達(dá)水平與Ki-67存在正相關(guān);有吉非替尼作用時(shí),Ki-67的表達(dá)水平明顯下降。結(jié)論:1 Cav-1表達(dá)水平與肺腺癌EGFR-TKIs療效呈負(fù)相關(guān);2敲低Cav-1表達(dá)可抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,增加其對(duì)EGFR-TKIs的敏感性;3過表達(dá)Cav-1可促進(jìn)腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,降低其對(duì)EGFR-TKIs的敏感性;4 Cav-1通過調(diào)控EGFR的磷酸化水平,激活下游的MAPK和PI3K信號(hào)通路,進(jìn)而促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng),降低EGFR-TKIs的敏感性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 石磊;;EGFR-TKIs治療非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展[J];菏澤醫(yī)學(xué)專科學(xué)校學(xué)報(bào);2011年04期

2 趙俊華;范增慧;趙玉霞;;EGFR-TKIs聯(lián)合放療在局部晚期非小細(xì)胞肺癌治療中的地位和作用[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2012年10期

3 馬升軍;陳虹;;EGFR突變與EGFR-TKIs在非小細(xì)胞肺癌中的研究進(jìn)展[J];廣東醫(yī)學(xué);2011年08期

4 何萍;王燕;楊晟;于舒飛;王子平;李峻嶺;王彬;郝學(xué)志;王宏羽;胡興勝;張湘茹;石遠(yuǎn)凱;;191例EGFR突變狀態(tài)不明晚期肺腺癌患者EGFR-TKIs耐藥后化療的療效分析[J];中國(guó)肺癌雜志;2013年10期

5 李孌;高亞杰;董巖;朱海波;徐小玉;王玲;;EGFR-TKIs治療非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展[J];中國(guó)老年學(xué)雜志;2013年13期

6 隆艷艷;戴廣海;;胰腺癌中EGFR、Kras及PI3K/Akt通路對(duì)EGFR-TKIs療效預(yù)測(cè)的研究[J];軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào);2011年11期

7 姜丹丹;趙明;;EGFR-TKIs相關(guān)重度皮疹的治療和護(hù)理[J];軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào);2011年05期

8 ;[J];;年期

相關(guān)會(huì)議論文 前2條

1 范云;;EGFR-TKIs治療非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移的再認(rèn)識(shí)[A];第八屆全國(guó)癌癥康復(fù)與姑息醫(yī)學(xué)大會(huì)論文匯編[C];2012年

2 范云;黃志煜;方羅;繆路路;林能明;龔磊;楊海燕;余海峰;;化療及EGFR-TKIs治療非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移:210例患者的生存分析[A];第八屆全國(guó)癌癥康復(fù)與姑息醫(yī)學(xué)大會(huì)論文匯編[C];2012年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 劉穎慧;EGFR-TKIs耐藥NSCLC細(xì)胞株的建立及耐藥機(jī)制的初步探討[D];北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所;2016年

2 崔玉潔;Caveolin-1對(duì)EGFR突變陽(yáng)性肺腺癌EGFR-TKIs敏感性的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2017年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 金浩;比較EGFR-TKIs與含鉑雙藥一線化療后培美曲塞維持治療EGFR突變陽(yáng)性的晚期非小細(xì)胞肺腺癌的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

2 高媛妍;放療聯(lián)合EGFR-TKIs治療非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移療效及安全性的meta分析[D];吉林大學(xué);2016年

3 陳敏;非小細(xì)胞肺癌患者EGFR突變狀態(tài)與臨床分期的關(guān)系及EGFR-TKIs療效預(yù)測(cè)因素探索的多中心臨床回顧性研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

4 孫紅娜;EGFR-TKIs治療EGFR突變陽(yáng)性的晚期非小細(xì)胞肺腺癌的臨床研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2016年

5 崔晶剛;肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)敏感非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs耐藥及機(jī)制的研究[D];延邊大學(xué);2015年

6 張銘玉;全腦放療聯(lián)合EGFR-TKIs與聯(lián)合化療治療非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移的臨床研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2017年

7 蔡明輝;EGFR-TKIs對(duì)EGFR突變肺癌新生淋巴管的影響[D];上海交通大學(xué);2014年

8 蔡忠福;基于2011年肺腺癌國(guó)際多學(xué)科分類探討EGFR突變?cè)诓±韥喰偷姆植技捌渑cEGFR-TKIs療效相關(guān)性研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2014年

9 王曉敏;晚期NSCLC中EGFR和EMT的檢測(cè)及其與EGFR-TKIs二線治療療效關(guān)系的研究[D];河北北方學(xué)院;2013年

10 張曦;IGF-1R在EGFR野生型非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKIs獲得性耐藥中的作用及機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2014年

，

本文編號(hào)：1532846