發(fā)布時(shí)間：2018-02-15 20:12

  本文關(guān)鍵詞： 缺氧 水代謝平衡紊亂 TRPV4 Adropin Minocycline 血腦屏障　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景和目的高原是我軍重要戰(zhàn)略方向。但是,高原環(huán)境特殊,嚴(yán)重影響部隊(duì)的戰(zhàn)斗力。如何從軍事斗爭的需要出發(fā),做好急進(jìn)高原部隊(duì)的衛(wèi)生保障,是我軍高原醫(yī)學(xué)研究的重要內(nèi)容。平原人進(jìn)入高原后,會出現(xiàn)急性高原病,包括高原肺水腫(High altitude pulmonary edema,HAPE)、高原腦水腫(High altitude cerebral edema,HACE)和急性高原反應(yīng)(Acute mountain sickness,AMS)。HAPE和HACE是機(jī)體水代謝紊亂的結(jié)果;對于AMS,有人認(rèn)為是輕度的高原腦水腫所致。不論是急性高原病患者還是進(jìn)入高原后的相對健康人,普遍存在著飲水減少、體重降低等現(xiàn)象。因此,急進(jìn)高原可引起機(jī)體以脫水或水腫為表現(xiàn)形式的水代謝紊亂。動物實(shí)驗(yàn)表明,急性低壓缺氧可顯著降低大鼠的飲水量。早在1981年就有人觀察了大鼠在模擬海拔5400m急性缺氧時(shí)飲水量的變化,發(fā)現(xiàn)在缺氧的第1天,大鼠飲水量只有平原正常值的30%。尿量雖也顯著減少,但減少的程度比飲水量的減少要輕,兩者相比,尿量相對增加,機(jī)體脫水、體重降低,血球壓積(Hematocrit,Hct)增加。進(jìn)一步的研究證明,急性缺氧降低大鼠飲水量不能用滲透壓感受器或容量感受器來解釋。而我們在預(yù)實(shí)驗(yàn)中注意到,大鼠一旦進(jìn)入缺氧環(huán)境,飲水行為立即減少,而脫離缺氧環(huán)境后飲水行為迅速恢復(fù)。我們推測,急性缺氧降低大鼠飲水量可能與中樞神經(jīng)因素有關(guān);飲水量下降的本質(zhì)可能是缺氧對渴覺神經(jīng)元的抑制或渴覺抑制性神經(jīng)元的興奮所致。參與大腦渴覺調(diào)節(jié)的神經(jīng)核團(tuán)很多。研究表明,前扣帶回皮層(Anterior cingulate cortex,ACC)是渴覺調(diào)節(jié)的高級中樞,而室周器官(Circumventricular organs,CVOs)是渴覺信號的感知者和啟動者。穹窿下器(Subfornical organ,SFO)位于CVOs的中央,周圍富集大量血管及脈絡(luò)膜,且缺乏血腦屏障,易受氧分壓的影響。因此我們推測,SFO區(qū)的神經(jīng)元有可能直接感知氧分壓變化,進(jìn)而影響動物的飲水行為。研究發(fā)現(xiàn),SFO神經(jīng)元上的辣椒素受體(transient receptor potential-vanilloids,TRPVs)是渴覺興奮產(chǎn)生的關(guān)鍵分子,主要包括TRPV1和TRPV4。有人通過中樞注射TRPV4激動劑,發(fā)現(xiàn)大鼠飲水量顯著降低。也有實(shí)驗(yàn)證明,TRPV4對低氧分壓十分敏感,是動物缺氧性肺血管收縮的重要因素。我們推測,缺氧有可能直接激活SFO區(qū)神經(jīng)元上的TRPV4,導(dǎo)致大鼠飲水量減少。人和動物對高原缺氧環(huán)境的習(xí)服是在神經(jīng)體液的整體調(diào)控下完成的。除了神經(jīng)機(jī)制外,體液機(jī)制在缺氧大鼠飲水減少中可能也發(fā)揮著重要作用。文獻(xiàn)表明,Adropin是由Enho基因編碼的分泌型小分子蛋白,能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的物質(zhì)代謝,且中樞注射Adropin能顯著減少大鼠的飲水量。我們在預(yù)實(shí)驗(yàn)中也觀察到缺氧大鼠血清中Adropin含量增高,因此,Adropin有可能是缺氧大鼠飲水量減少的體液機(jī)制之一。中度缺氧時(shí),機(jī)體以習(xí)服代償為主,但嚴(yán)重缺氧會引起血腦屏障(Blood brain barrier,BBB)的損傷和通透性增高。BBB由血管內(nèi)皮細(xì)胞及其緊密連接、基膜及周圍的星型膠質(zhì)細(xì)胞足突、周細(xì)胞等結(jié)構(gòu)組成,是極其穩(wěn)定的中樞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持屏障。嚴(yán)重缺氧損傷BBB的原因包括內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和緊密連接蛋白降解,但相關(guān)分子機(jī)制仍未完全闡明。因此,探索BBB損傷的原因及分子機(jī)制,將有助于尋找HACE和AMS預(yù)防和治療方法。綜上所述,本課題擬在前期工作的基礎(chǔ)上,從缺氧飲水減少和BBB損傷兩個(gè)方向,研究急性缺氧大鼠水代謝紊亂的發(fā)生機(jī)制,這不僅有助于提高我們對高原習(xí)服機(jī)制的認(rèn)識,也為我們做好急進(jìn)高原部隊(duì)的衛(wèi)勤保障奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。材料與方法1.本研究采用動物低壓艙建立大鼠缺氧模型。分別在模擬3700m、4000m、6000m缺氧條件下研究大鼠飲水減少的發(fā)生及分子機(jī)制,在模擬8000m缺氧條件下研究血腦屏障損傷及修復(fù)方法。采用低氧細(xì)胞培養(yǎng)箱和三氣缺氧小室,在體外構(gòu)建細(xì)胞缺氧模型。2.采用大鼠顱內(nèi)置管技術(shù),缺氧前10min,腦室注射TRPV1抑制劑SB-705498,TRPV4抑制劑Gadolinium和HC-067047,缺氧相應(yīng)時(shí)間后精確測量動物飲水量、顱內(nèi)溫度變化、滲透壓變化。體外培養(yǎng)SFO區(qū)原代神經(jīng)元和HEK293細(xì)胞,分別通過質(zhì)粒和si RNA干預(yù)建立TRPV4過表達(dá)和敲降模型,利用Westernblot、Co-IP、IF、ELISA及Fura-3鈣成像技術(shù)檢測TRPV4蛋白表達(dá)及鈣通道開放情況。3.采用大鼠顱內(nèi)置管技術(shù),在大鼠缺氧前7d,特異性的AVV-sh RNA靶向敲降CVOs區(qū)TRPV4表達(dá),通過中樞注射重組Adropin蛋白、TRPV4抑制劑HC-067047,Cam KK抑制劑STO-609,外周注射高濃度Adropin抗體等方法,缺氧相應(yīng)時(shí)間后測量動物飲水量、IF檢測神經(jīng)元活性、Westernblot檢測TRPV4-Cam KK-AMPK信號通路變化;4.采用大鼠顱內(nèi)置管技術(shù),大鼠缺氧前48h,通過si RNA靶向敲降SIRT-3,缺氧前1h腹腔注射不同濃度的Minocycline,采用膠體金-電鏡和伊文思藍(lán)示蹤法檢測血腦屏障功能;在HBMECs細(xì)胞中,利用Westernblot、q RT-PCR、IF、螢光素酶報(bào)告基因法,檢測HIF-1α/SIRT-3/PHD-2信號通路和緊密連接蛋白表達(dá)變化。結(jié)果1.與常氧組相比,大鼠4000m缺氧6h不會引起血液滲透壓改變及顱內(nèi)溫度變化,但是飲水量下降75%;與缺氧組相比,第三腦室注射TRPV4抑制劑Gadolinium和HC-067047,能夠顯著增加飲水量,而TRPV1抑制劑SB-705498不會引起飲水量增加;此外,與野生型相比,常氧條件下TRPV4-/-小鼠飲水量沒有明顯變化,但是在缺氧條件下,TRPV4-/-小鼠飲水量顯著增加。無論是過表達(dá)TRPV4的HEK293細(xì)胞,還是原代培養(yǎng)的SFO區(qū)神經(jīng)元,缺氧或TRPV4激動劑4α-PDD都會使胞內(nèi)鈣離子迅速增加,產(chǎn)生鈣離子脈沖,但是,在普通HEK293細(xì)胞或敲降TRPV4的SFO神經(jīng)元中,缺氧幾乎不能產(chǎn)生鈣離子脈沖;在表達(dá)TRPV4的HEK293細(xì)胞和原代培養(yǎng)的SFO區(qū)神經(jīng)元中敲降血紅素氧合酶-2(heme oxygenase-2,HO-2)后,缺氧產(chǎn)生鈣離子脈沖明顯減弱,但此時(shí)TRPV4激動劑4α-PDD和抑制劑Gadolinium仍然能調(diào)控胞內(nèi)鈣離子變化;TRPV4和HO-2在SFO神經(jīng)元中以二聚體的形式存在。2.與常氧組相比,大鼠3700m缺氧血清和CVOs區(qū)腦組織Adropin蛋白增加,同時(shí)CVOs區(qū)c-Fos陽性細(xì)胞數(shù)減少;與單純?nèi)毖踅M相比,注射Adropin中和抗體后飲水量升高35%,c-Fos陽性細(xì)胞數(shù)增加60%。常氧情況下,大鼠中樞注射重組Adropin蛋白后飲水量和CVOs區(qū)c-Fos陽性細(xì)胞數(shù)均顯著減少;而與對照組相比,TRPV4敲降組注射重組Adropin蛋白后飲水量和c-Fos陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加。與對照組相比,中樞注射重組Adropin蛋白后CVOs區(qū)p-Cam KK、p-AMPKα蛋白顯著增加,c-Fos陽性細(xì)胞數(shù)減少,大鼠飲水量下降;而注射TRPV4抑制劑HC-067047或Cam KK抑制劑STO-609均能降低CVOs區(qū)p-Cam KK、p-AMPKα蛋白的表達(dá),增加c-Fos陽性細(xì)胞數(shù),部分恢復(fù)大鼠飲水量。3.與常氧組相比,8000m缺氧伊文思藍(lán)和膠體金血腦屏障通透性顯著增高,HBMECs細(xì)胞跨細(xì)胞電阻TEER減小,HIF-1α、MMP9、MMP2和VEGF蛋白及m RNA表達(dá)顯著增加,緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白及m RNA降低,HIF-1α對VEGF轉(zhuǎn)錄活性顯著增高。與溶劑對照組相比,Minocycline劑量依賴性的降低伊文思藍(lán)和膠體金通透性,增加內(nèi)皮細(xì)胞TEER,下調(diào)MMP9、MMP2和VEGF蛋白及m RNA表達(dá),但Minocycline僅能上調(diào)HIF-1α蛋白而非m RNA表達(dá),Minocycline能同時(shí)上調(diào)ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白及m RNA表達(dá)。然而,HIF-1α抑制劑YC-1或穩(wěn)定劑DMOG均能調(diào)控Minocycline引起的上述變化。與常氧組相比,缺氧誘導(dǎo)HIF-1α上調(diào)的同時(shí)顯著下調(diào)SIRT-3和PHD-2蛋白表達(dá),與缺氧組相比,Minocycline抑制HIF-1α同時(shí)上調(diào)SIRT-3和PHD-2蛋白表達(dá),SIRT-3敲降后Minocycline對HIF-1α的抑制作用減弱,SIRT-3和PHD-2顯著上調(diào)。結(jié)論1.急性缺氧可引起大鼠飲水量減少,嚴(yán)重的急性缺氧可損傷大鼠血腦屏障。2.急性缺氧大鼠飲水減少與中腦SFO區(qū)神經(jīng)元TRPV4開放密切相關(guān)。TRPV4與HO-2在SFO區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞膜上以復(fù)合體的形式存在。缺氧時(shí),大鼠飲水減少有可能是通過HO-2感知氧分壓變化、開放效應(yīng)分子TRPV4引起中樞SFO區(qū)神經(jīng)元胞漿[Ca2+]i升高,進(jìn)而抑制口渴中樞所致。3.急性缺氧引起小分子蛋白Adropin表達(dá)增高參與大鼠飲水減少的機(jī)制。Adropin通過作用于中樞CVOs區(qū)TRPV4鈣離子通道,引起其下游鈣離子相關(guān)的Camkk-AMPK信號通路磷酸化,活化TRPV4渴覺抑制性神經(jīng)元,減少大鼠飲水量。4.嚴(yán)重缺氧損傷血腦屏障,Minocycline通過激活SIRT-3/PHD-2信號通路,促進(jìn)HIF-1α降解,使HIF-1α介導(dǎo)的VEGF、MMP-2、MMP-9表達(dá)減少,而內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白表達(dá)上調(diào),保護(hù)血腦屏障。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:在進(jìn)入高原后的早期,飲水減少是中樞神經(jīng)主動抑制的結(jié)果。對于急進(jìn)特高海拔或嚴(yán)重缺氧的人來講,Minocycline可望成為防治高原腦水腫的潛在藥物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R82

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2 祝~=驤;iJ梊霞;洃克琴;崔素英;文允摪;，

本文編號：1513787