本文關鍵詞： 二硫環(huán)化FITC-PI 小分子多肽 乳腺癌 肺癌 腫瘤靶向治療 跨膜轉導 穿膜機制 分泌性載體膜蛋白4 泛素-C蛋白　出處：《昆明醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：[目的]本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)了一種具有僅對人三陰乳腺癌細胞(MDA-MB-231)和人肺癌細胞(Calu-1)這兩種細胞系具有特異親和性的11肽,將其進行FITC熒光標記后我們觀察到其能夠穿膜進入MDA-MB-231和Calu-1細胞并在胞漿內(nèi)定位,后續(xù)實驗提示,將此小肽兩端添加二硫鍵環(huán)化處理后其特異性穿膜效應效果最佳(將此小肽命名為二硫環(huán)化FITC-PI),進一步體內(nèi)外研究提示,二硫環(huán)化FITC-PI自身能夠靶向定位于靶細胞,并表現(xiàn)出良好的載體特性�；谇捌谘芯拷Y果,本課題論文主要探討二硫環(huán)化FITC-PI的靶向跨膜轉移機制,揭示并定位MDA-MB-231和Calu-1細胞膜蛋白中介導二硫環(huán)化FITC-PI跨膜轉運的特異性轉導膜蛋白,分析此膜蛋白中與二硫環(huán)化FITC-PI跨膜轉運功能密切相關的膜蛋白功能結構域,并進一步探索與二硫環(huán)化FITC-PI在胞漿內(nèi)協(xié)同轉運直接相關的胞漿蛋白及胞漿定位表達,為二硫環(huán)化FITC-PI應用于腫瘤靶向治療及早期診斷方面提供實驗依據(jù)。[方法]1.通過對人乳腺癌MDA-MB-231及人肺癌Calu-1細胞的各自20個STR位點及1個Amelogenin性別位點進行STR位點檢測,與ATCC、DSMZ、JCRB和RIKEN的對應細胞系進行比對,觀察本實驗室保存用于本實驗的MDA-MB-231及Calu-1細胞無交叉污染后,人工合成標記FITC綠色熒光的二硫鍵環(huán)化FITC-PI。2.利用四種細胞膜非特異性通道抑制劑(包括氯丙嗪、制霉菌素、鹽酸阿米洛利以及磷酸氯喹)分別阻斷靶細胞膜上的巨胞飲、網(wǎng)格蛋白依賴途徑、胞膜窖介導途徑以及內(nèi)涵體成熟介導非特異性內(nèi)吞途徑,檢測阻斷前后二硫環(huán)化FITC-PI在細胞中的表達,觀察二硫環(huán)化FITC-PI是否可通過細胞膜上的非特異性穿膜機制發(fā)揮其穿膜效應。3.前期實驗中我們發(fā)現(xiàn)二硫環(huán)化FITC-PI僅對MDA-MB-231和Calu-1細胞有特異性穿膜效應,因此,我們認為MDA-MB-231和Calu-1細胞膜上可能具有相同或類似的可協(xié)助二硫環(huán)化FITC-PI特異性穿膜的膜蛋白,因此,我們選擇iTRAQ技術將MDA-MB-231及Calu-1細胞的全部胞膜蛋白進行分析及鑒定,我們選擇人乳腺癌MCF-7細胞(前期實驗中已證實二硫環(huán)化FITC-PI不能穿膜的細胞之一)全部膜蛋白數(shù)據(jù)作為對照,通過蛋白預測軟件,篩選出與二硫環(huán)化FITC-PI特異性穿膜進入MDA-MB-231和Calu-1細胞的轉運關鍵膜蛋白為SCAMP4蛋白,采用COMPARTMENTS數(shù)據(jù)庫分析SCAMP4蛋白在細胞內(nèi)的定位情況。通過RT-PCR及Western-blot檢測SCAMP4蛋白是否存在于MDA-MB-231和Calu-1細胞并對其表達量進行分析。4.在證實SCAMP4蛋白在MDA-MB-231和Calu-1細胞真實存在后,我們進一步利用Label free法對于MDA-MB-231及Calu-1細胞的全部胞漿蛋白數(shù)據(jù)進行分析,隨后采用string軟件構建SCAMP4蛋白協(xié)助二硫環(huán)化FITC-PI穿膜進入細胞并在胞漿內(nèi)的蛋白相互作用網(wǎng)絡,將此蛋白互做網(wǎng)絡中與SCAMP4蛋白發(fā)生作用的漿蛋白節(jié)點蛋白數(shù)據(jù)與MDA-MB-231及Calu-1中胞漿蛋白數(shù)據(jù)進行比對,完整繪制二硫環(huán)化FITC-PI在細胞膜蛋白SCAMP4蛋白協(xié)同下轉運進入細胞后在細胞漿內(nèi)轉運信號網(wǎng)絡。[結果]1.經(jīng)過對MDA-MB-231以及Calu-1細胞的各自20個STR位點及1個Amelogenin性別位點進行STR位點檢測,證實本實驗所采用的MDA-MB-231及Calu-1細胞與ATCC、DSMZ、JCRB和RIKEN的對應細胞系為同一遺傳背景來源的細胞,由此進行的細胞后續(xù)實驗無誤,具備可重復性。同時,本實驗成功合成了二硫環(huán)化FITC-PI并對其進行鑒定。實驗結果證實,重新優(yōu)化并合成的二硫環(huán)化FITC-PI能夠特異性的穿膜進入MDA-MB-231以及Calu-1細胞中。2.在非特異跨膜轉運機制研究中,我們發(fā)現(xiàn),二硫環(huán)化FITC-PI可通過直接轉運方式穿膜進入MDA-MB-231以及Calu-1細胞。二硫環(huán)化FITC-PI可通過胞膜窖介導、巨胞飲介導以及干擾內(nèi)涵體成熟的細胞內(nèi)吞方式穿膜進入MDA-MB-231細胞,二硫環(huán)化FITC-PI可通過胞膜窖介導、巨胞飲介導的細胞內(nèi)吞方式進入Calu-1細胞。3.分別提取MDA-MB-231、Calu-1及MCF-7細胞膜蛋白,通過iTRAQ技術將上述三株細胞的膜蛋白進行對比分析,研究結果發(fā)現(xiàn):MDA-MB-231及Calu-1細胞(相對于MCF-7細胞)高表達或特有的(P0.05)膜上轉運蛋白包括 B3KVN0,Q9ULF5,Q14332,B4DTS6,095864,P48509,SCAMP4,F8WDZ3,Q14114,B3KQX7。在 MDA-MB-231 及 Calu-1 細胞中都檢測到但在MCF-7系中沒有檢測到的膜蛋白有HOY544,B7Z1M0,AOAOS2Z5F9,C9KOC8。利用Uniport蛋白數(shù)據(jù)庫對上述膜蛋白的功能進行預測分析,我們發(fā)現(xiàn),僅有SCAMP4是與蛋白轉運特別是小肽跨膜轉運密切相關的,提示:在MDA-MB-231及Calu-1細胞系中高表達而相對于MCF-7細胞中低表達的轉運膜蛋白SCAMP4是與二硫環(huán)化FITC-PI特異性穿膜密切相關的。隨后利用 COMPARTMENTS(Subcellular localization database)數(shù)據(jù)庫針對SCAMP4的細胞膜定位分析,結果發(fā)現(xiàn)SCAMP4蛋白在細胞質膜上表達,同時,在高爾基體上也有較少表達。4.我們進一步利用Label free法對于MDA-MB-231及Calu-1細胞的全部胞漿蛋白數(shù)據(jù)進行分析及鑒定,隨后采用string軟件構建SCAMP4蛋白穿膜進入細胞并在胞漿內(nèi)的蛋白相互作用網(wǎng)絡,將此蛋白互做網(wǎng)絡中與SCAMP4蛋白發(fā)生作用的漿蛋白節(jié)點蛋白數(shù)據(jù)與MDA-MB-231及Calu-1中胞漿蛋白數(shù)據(jù)進行比對,我們發(fā)現(xiàn),能夠與SCAMP4蛋白直接作用的而且存在于MDA-MB-231及Calu-1細胞中的胞漿蛋白為polyubiquitin C蛋白。因此,polyubiquitin C蛋白應該是SCAMP4蛋白轉運外源性物質進入細胞后并導入胞漿的一個協(xié)同蛋白。此后,我們將SCAMP4蛋白的4個跨膜結構域序列與二硫環(huán)化FITC-PI的蛋白序列進行了同源性比對分析,結果發(fā)現(xiàn),二硫環(huán)化FITC-PI與SCAMP4第一個跨膜區(qū)域的蛋白序列有重疊,提示二硫環(huán)化FITC-PI可能是通過與SCAMP4第一個跨膜區(qū)域特異性結合后跨膜進入細胞。[結論]1.本研究制備的二硫環(huán)化FITC-PI可通過直接轉運方式穿膜進入人乳腺癌MDA-MB-231細胞及人肺癌Calu-1細胞:二硫環(huán)化FITC-PI可通過胞膜窖介導、巨胞飲介導以及干擾內(nèi)涵體成熟的細胞內(nèi)吞方式穿膜進入人乳腺癌MDA-MB-231細胞;二硫環(huán)化FITC-PI可通過胞膜窖介導、巨胞飲介導的細胞內(nèi)吞方式穿膜人肺癌Calu-1細胞。2.本研究通過iTRAQ技術篩選得到與二硫環(huán)化FITC-PI特異性內(nèi)化進入人乳腺癌細胞MDA-MB-231、人肺癌細胞Calu-1細胞的跨膜轉運相關蛋白SCAMP4。SCAMP4蛋白是在人乳腺癌細胞MDA-MJB-231、人肺癌細胞Calu-1細胞系中高表達而相對于人乳腺癌細胞MCF-7中低表達的。3.SCAMP4蛋白是協(xié)助二硫環(huán)化FITC-PI穿膜進入MDA-MB-231及Calu-1的特異性膜蛋白,SCAMP4蛋白定位于細胞質膜上,SCAMP4蛋白的第一個跨膜區(qū)域與二硫環(huán)化FITC-PI穿膜有關。4.胞漿蛋白polyubiquitinC是胞膜蛋白SCAMP4在細胞內(nèi)蛋白互作體。二硫環(huán)化 FITC-PI 穿膜進入 MDA-MB-231 與 Calu-1 細胞后,在 polyubiquitin C 協(xié)同下,二硫環(huán)化FITC-PI轉運至胞漿中。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

【參考文獻】

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本文編號：1504410