發(fā)布時間：2018-01-26 14:46

  本文關鍵詞： 肝癌 慢性應激 交感神經系統(tǒng) β2腎上腺素能受體 轉移　出處：《第三軍醫(yī)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：1.研究背景和意義肝癌是最常見的惡性腫瘤之一,超過一半的肝癌患者來自于中國。肝癌的轉移和復發(fā)是導致肝癌患者預后較差的主要原因。研究肝癌轉移的分子機制對于肝癌的治療有重要的意義。目前,醫(yī)學模式已經向生物-心理-社會醫(yī)學模式轉變,社會心理因素對惡性腫瘤的影響引起了越來越多的關注。研究表明惡性腫瘤患者長期處于應激狀態(tài),慢性應激被證實通過調控腫瘤細胞,腫瘤微環(huán)境和機體免疫系統(tǒng)等影響腫瘤的進展。慢性應激能夠促進交感神經系統(tǒng)(sympathetic nervous system,SNS)活化釋放兒茶酚胺類應激激素,交感神經系統(tǒng)對腫瘤發(fā)生發(fā)展具有調控作用,去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE)被證實能夠促進腫瘤細胞侵襲和遷移。但慢性應激是否通過激活SNS調控肝癌的轉移還未見報道,因此,研究肝癌患者慢性應激狀態(tài)對腫瘤進展的影響將從心理-神經-內分泌的全新角度闡釋肝癌轉移的分子機制,揭示慢性應激促肝癌轉移的新理論。腫瘤細胞的侵襲和遷移能力的改變是一個復雜的過程,腫瘤細胞骨架重塑,細胞粘附力改變以及上皮-間質樣轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的發(fā)生是腫瘤細胞轉移的重要因素。交感神經末梢分布于多種腫瘤組織,研究表明應激激素NE能夠通過激動卵巢癌細胞表面腎上腺素受體(Adrenergic receptors,ARs)介導人端粒酶逆轉錄酶的表達,調控卵巢癌細胞發(fā)生EMT;還能夠通過激活β-AR/HIF-1α信號通路促進腫瘤細胞發(fā)生EMT,進而調控胃癌和結腸癌細胞的侵襲和轉移。肝癌患者長期的慢性應激狀態(tài)是否通過激活SNS釋放應激激素直接激動肝癌細胞表面ARs,介導肝癌細胞發(fā)生EMT仍不清楚。本研究的目的是:1.研究肝癌患者慢性應激狀態(tài)對肝癌轉移及預后的影響;2.探討慢性應激激活交感神經系統(tǒng)調控肝癌細胞關鍵ARs及下游信號通路活化促肝癌細胞EMT發(fā)生的分子機制。闡明慢性應激促肝癌轉移的分子機制將為尋找防治肝癌轉移的新策略提供理論基礎和實驗依據。2.主要研究方法(1)通過心率變異分析儀檢測肝癌患者應激指數(shù)和心率變異性(Heart rate variability,HRV)指標變化情況,利用ELISA檢測肝癌患者血中NE和腎上腺素(Epinephrine,EPI)的濃度;建立肝癌患者慢性應激評價體系,并分析肝癌患者慢性應激狀態(tài)與肝癌患者臨床病理特征,術后復發(fā)、轉移及生存時間的相關性。(2)構建穩(wěn)定表達熒光素酶基因的肝癌細胞株(SMMC-7721-Luc-cherry),并以此細胞建立裸鼠慢性應激-肝癌原位移植瘤模型,利用小動物成像系統(tǒng)觀察慢性應激狀態(tài)對肝癌原位移植瘤轉移的影響,研究慢性應激對荷瘤裸鼠生存時間的影響。(3)基于裸鼠慢性應激-肝癌原位移植瘤模型,利用小動物活體成像系統(tǒng)觀察6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamin,6-OHDA)化學性去除交感神經末梢后慢性應激刺激對移植瘤模型中肝癌轉移的影響,闡明慢性應激通過激活交感神經系統(tǒng)促進肝癌轉移。(4)RT-PCR和免疫熒光檢測肝癌細胞表達ARs情況,利用交感神經遞質(去甲腎上腺素等)和多種腎上腺素受體阻滯劑(普萘洛爾等)作用于肝癌細胞,通過Transwell侵襲和遷移實驗,劃痕實驗,Western blot等離體研究交感神經遞質對肝癌細胞侵襲和遷移的影響,篩選出介導肝癌細胞侵襲和轉移能力改變的重要腎上腺素能受體亞類。(5)利用慢病毒質粒干擾與調控肝癌細胞侵襲和轉移有關的腎上腺素受體亞型,基于慢性應激-裸鼠肝癌原位移植瘤模型研究明確在慢性應激調控肝癌轉移的進程中,發(fā)揮關鍵作用的腎上腺素能受體亞型。(6)通過慢病毒質粒干擾或特異性阻滯劑阻斷關鍵腎上腺素受體,利用Transwell侵襲和遷移實驗,Western blot實驗等,研究激動關鍵腎上腺素受體介導肝癌細胞侵襲轉移相關因子表達促進肝癌細胞侵襲和轉移的分子機制,明確肝癌細胞EMT重要基因的調控作用。(7)利用原子力顯微鏡,免疫熒光等技術研究激動肝癌細胞關鍵腎上腺素受體促其轉移進程中,細胞形態(tài),細胞骨架和細胞硬度等生物力學特征的變化,證實肝癌細胞在這一進程中發(fā)生了EMT。(8)通過PCR芯片檢測與調控肝癌進展相關的84種基因,找到激動肝癌細胞關鍵腎上腺素能受體參與調控EMT進程的重要信號分子,探討激動關鍵腎上腺素受體對該信號分子的調控作用。(9)利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)和染色質免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP)實驗等,研究關鍵AR及其下游信號轉導通路在介導EMT調控轉錄因子活化中的作用,闡明激動關鍵AR介導下游信號通路活化促肝癌細胞EMT的分子機制。(10)通過免疫組化實驗等研究臨床肝癌標本中關鍵信號分子的表達情況及其與肝癌患者應激指數(shù),應激激素和患者臨床病理特征以及預后的相關性。3.結果(1)心率變異分析和血液NE和EPI濃度檢測結果顯示:肝癌患者應激指數(shù),HRV水平分別與應激激素具有明顯的相關性,利用三者聯(lián)合可以較好的評估肝癌患者慢性應激狀態(tài)。進一步分析發(fā)現(xiàn)應激指數(shù)高低與腫瘤大小,血管癌栓,肝內轉移,TNM分期,術后復發(fā)情況明顯相關,還與肝癌患者的無疾病生存期和總生存期呈負相關關系;HRV時間域指標竇性心搏RR間期標準差(Standard deviation of the NN intervals,SDNN;相鄰RR間期差值的均方根(Square root of the mean squared differences of successive NN intervals,RMSSD)和頻率域指標低頻率(Low frequency,LF),高頻率(High frequency,HF),總功率(Total power,TP)的高低與肝癌患者的無疾病生存期,總生存期呈正相關�；颊哐袘ぜに豊E濃度與血管癌栓,TNM分期,術后復發(fā)具有明顯相關性;EPI濃度與腫瘤大小,血管癌栓,分化程度,TNM分期和術后復發(fā)有關;且NE和EPI濃度均與肝癌患者無疾病生存期和總生存期呈負相關。(2)小動物活體成像結果提示:慢性應激能夠促進肝癌原位移植瘤模型中肝癌的肝內和遠處轉移;ELISA檢測結果發(fā)現(xiàn)慢性應激能夠促進裸鼠肝組織內NE和EPI濃度上升,高濃度的NE和EPI可能與模型中肝癌的轉移有關;生存分析提示慢性應激能夠明顯縮短荷瘤裸鼠的總生存期。(3)6-OHDA去除交感神經纖維后,明顯降低了慢性應激刺激對移植瘤模型中肝癌轉移的促進作用;肝組織內的NE和EPI濃度也明顯降低;去除交感神經末梢后能夠延長慢性應激狀態(tài)下荷瘤裸鼠的總生存期。(4)免疫熒光和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)多種肝癌細胞表達腎上腺素能受體。Transwell,劃痕實驗結果顯示:去甲腎上腺素能夠促進肝癌細胞的侵襲和遷移,利用阻滯劑阻斷β-ARs能夠抑制肝癌細胞的侵襲和遷移,而α-ARs阻滯劑抑制肝癌細胞侵襲和遷移的作用不明顯。RT-PCR和Western blot檢測與侵襲轉移相關的蛋白發(fā)現(xiàn):激動肝癌細胞β-ARs上皮樣標記E-cadherin下調,間質樣標記N-cadherin和Vimentin上調,阻斷β-ARs后這種調控作用受到抑制;而阻斷β-ARs對基質金屬蛋白酶2和9(matrix metalloproteinase 2,MMP2;matrix metalloproteinase 9,MMP9)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等的抑制作用不明顯。(5)利用慢病毒干擾質粒分別干擾β1-,β2-,β3-AR,小動物活體成像結果提示:干擾β2-AR能夠抑制慢性應激促移植瘤模型中肝癌的肝內和遠處轉移的作用,而干擾β1,β3-AR對肝癌轉移的影響不大;生存分析還發(fā)現(xiàn)干擾β2-AR能夠延長慢性應激狀態(tài)下荷瘤裸鼠的總生存期。(6)Transwell侵襲和遷移實驗發(fā)現(xiàn),激動β2-AR能夠促進肝癌細胞侵襲和遷移,干擾或阻滯β2-AR能夠抑制肝癌細胞侵襲和遷移;Western blot結果證實異丙腎上腺素(Isoprenaline,ISO)激動β2-AR能夠抑制肝癌細胞E-cadherin的表達,促進N-cadherin和Vimentin的表達,干擾或特異性阻斷β2-AR能夠抑制ISO對這三個蛋白的調控作用。RT-PCR和Western blot實驗結果發(fā)現(xiàn)激動β2-AR能夠促進EMT調控轉錄因子Vimentin的表達,干擾或阻滯后能夠抑制其表達。(7)原子力顯微鏡觀察掃描后發(fā)現(xiàn):激動β2-AR能夠促進肝癌細胞形態(tài)發(fā)生變化,細胞間緊密連接減弱,伸出偽足,細胞表面顆粒增多,粗燥程度變大,特異性阻斷β2-AR后,能夠抑制細胞形態(tài)的改變。免疫熒光檢測骨架蛋白Vimentin和F-肌動蛋白(F-actin)后發(fā)現(xiàn)激動β2-AR促進Vimentin表達上調和F-actin累積,且F-actin出現(xiàn)異常排列和形態(tài),阻滯β2-AR后Vimentin表達和F-actin累積減少,細胞骨架重塑受到抑制。原子力顯微鏡檢測肝癌細胞硬度后發(fā)現(xiàn),ISO能夠降低肝癌細胞硬度(硬度越小說明細胞的形變能力越大),阻滯了β2-AR后肝癌細胞的硬度升高。(8)PCR芯片結果提示:與對照組相比,ISO激動肝癌細胞β2-AR能夠調控基因表達差異大于5倍以上的,且與肝癌進展相關的基因有8個:ANGPT2,CCL5,EGF,LEF1,MTDH,STAT3,PIN1;其中CDH1(E-cadherin)為明顯下調的基因。進一步分析發(fā)現(xiàn),與激動劑組相比,ISO+ICI118551(β2-AR特異性阻滯劑)組表達下調超過5倍的基因有4個:Myc,CCND1,LEF1;而CDH1(E-cadherin)明顯上調。其中LEF1和CDH1(E-cadherin)基因的在兩組中表達差異有明顯此消彼長的現(xiàn)象,說明激動β2-AR對上述兩個基因具有明顯的調控作用。利用RT-PCR和Western blot驗證LEF1(CDH1(E-cadherin)在之前的研究中已經證實了β2-AR對其表達的調控作用)在SMMC-7721和Hep G2肝癌細胞的表達發(fā)現(xiàn),激動β2-AR能促進LEF1蛋白和轉錄水平的表達,而阻滯β2-AR能夠抑制其表達。(9)根據PCR芯片結果,激動或阻滯β2-AR后參與侵襲轉移調控的基因LEF1和Myc,CCND1,MTDH等的表達發(fā)生變化,而LEF1等這些基因均與β-catenin信號通路的活化相關。進一步分析芯片結果發(fā)現(xiàn)β-catenin在激動或阻滯肝癌細胞β2-AR后沒有明顯表達變化,Western blot檢測也發(fā)現(xiàn)蛋白水平的β-catenin在兩組間沒有表達差異。文獻檢索發(fā)現(xiàn)β-catenin信號通路的激活多與其核內表達上調有關,進一步通過免疫熒光和Western blot檢測發(fā)現(xiàn):激動肝癌細胞β2-AR能夠促進β-catenin細胞核內表達,特異性阻斷β2-AR抑制了β-catenin的入核。Western blot檢測還發(fā)現(xiàn)激動β2-AR后,隨著β-catenin核內表達增多,LEF1,Vimentin和N-cadherin上調,而E-cadherin表達降低。干擾β-catenin后能夠抑制β2-AR激動劑促肝癌細胞侵襲和遷移的作用。生物信息學分析提示β-catenin能夠入核與LEF1等轉錄因子形成復合物調控Vimentin轉錄,Ch IP實驗證實β-catenin能夠與Vimentin啟動子結合;雙熒光素酶報告基因檢測Vimentin啟動子活性,發(fā)現(xiàn)干擾β-catenin能夠抑制Vimentin的啟動子活性,證實β-catenin能夠調控Vimentin的轉錄介導肝癌細胞骨架重塑和EMT發(fā)生。(10)免疫組化檢測肝癌臨床標本中β-catenin的表達分布情況發(fā)現(xiàn):臨床肝癌標本中β-catenin的核表達與肝癌患者應激指數(shù),應激激素NE和EPI濃度呈正相關;進一步研究發(fā)現(xiàn)細胞核有β-catenin表達的患者總生存時間較短,證實慢性應激激活β2-AR促進β-catenin入核調控下游EMT基因表達是慢性應激促進肝癌轉移中的關鍵調控機制。4.結論(1)慢性應激通過激活交感神經系統(tǒng)促進肝癌轉移導致肝癌患者預后較差,評估肝癌患者慢性應激狀態(tài)有助于預測患者預后。(2)慢性應激通過激活交感神經系統(tǒng)釋放應激激素激動肝癌細胞β2-AR促進肝癌細胞骨架重塑和EMT。(3)慢性應激通過激動β2-AR介導β-catenin/LEF1/Vimentin信號通路活化調控肝癌細胞發(fā)生EMT,促進肝癌細胞侵襲和轉移。本課題從心理-神經-內分泌的角度研究慢性應激對肝癌轉移的促進作用,揭示了社會心理因素調控肝癌轉移的新理論;并對慢性應激介導β2-AR/β-catenin/LEF1/Vimentin信號通路活化促進肝癌細胞侵襲和轉移分子機制進行探討,為探索防治肝癌轉移的新策略提供理論基礎和實驗依據。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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