本文關(guān)鍵詞：亞型選擇性丙酮酸脫氫酶激酶不可逆抑制劑及抗耐藥金黃色葡萄球菌候選藥物開(kāi)發(fā)　出處：《華東理工大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：本論文由兩部分組成:第一部分是亞型選擇性丙酮酸脫氫酶激酶不可逆抑制劑的研究。癌細(xì)胞的代謝異常是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤組織有別于正常組織的特征之一。其中,以腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的代謝異常最為突出,主要表現(xiàn)為有氧糖酵解通路的增強(qiáng)和氧化磷酸化途徑的減弱,即腫瘤細(xì)胞即使在氧充足的條件下,也主要通過(guò)糖酵解的方式分解葡萄糖,而非通過(guò)三羧酸循環(huán)的氧化磷酸化途徑生產(chǎn)ATP,這種以有氧糖酵解為主的代謝方式被稱(chēng)之為"Warburg"效應(yīng)。這種看似低效的代謝方式能從能量和物質(zhì)等多個(gè)方面滿足腫瘤細(xì)胞增殖的特殊需求。此外,"Warburg"效應(yīng)還貢獻(xiàn)于腫瘤細(xì)胞的凋亡抵抗、惡性微環(huán)境的維持、轉(zhuǎn)移與耐藥等方面,是腫瘤細(xì)胞存活與增殖的基礎(chǔ)。酮酸脫氫酶激酶(PDK)能通過(guò)磷酸化丙酮酸脫氫酶(PDH)而改變細(xì)胞的葡萄糖代謝路徑,是細(xì)胞糖代謝調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。PDK有四種亞型(PDK1-4),它們?cè)谌梭w內(nèi)具有特異性的組織分布,其中PDK1在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中都異常高表達(dá),并且與癌癥患者的預(yù)后和生存、放化療響應(yīng)、耐藥的產(chǎn)生等密切相關(guān)。因此,PDK1已成為靶向腫瘤糖代謝的抗癌策略中極具潛質(zhì)的靶點(diǎn)。在本論文前,主要有三種PDK抑制劑類(lèi)型見(jiàn)諸報(bào)道,以不同的結(jié)合位點(diǎn)加以區(qū)分。第一類(lèi)抑制劑作用于丙酮酸結(jié)合位點(diǎn),代表性化合物是二氯乙酸(DCA),DCA可以看做是PDC底物丙酮酸的小分子類(lèi)似物,但其較弱的抗癌活性及往往需要過(guò)大給藥劑量(100 mg/kg)等因素影響了DCA的臨床應(yīng)用。第二類(lèi)抑制劑作用于二硫辛酸口袋,代表性化合物主要有Nov3r、AZD7545和CPI6I3。除了CPI613外,其它的該類(lèi)抑制劑抗癌效果較弱,而CPI613作為輔酶因子二硫辛酸的模擬物,其副作用涵待考察。第三類(lèi)抑制劑屬于ATP競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑,代表性化合物有Radicicol、M77976等,考慮到人體內(nèi)含有大量與ATP結(jié)合的酶,此類(lèi)抑制劑的選擇性往往較差,由此產(chǎn)生的副作用很難避免。在先前的工作中,本課題組通過(guò)對(duì)課題組內(nèi)老藥庫(kù)的PDK1抑制活性篩選及簡(jiǎn)單的化學(xué)改造發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)PDK1不可逆抑制劑JX06。以JX06為探針,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了抑制劑作用于PDK1一個(gè)全新的結(jié)合口袋,并闡明了其共價(jià)修飾的酶活調(diào)控機(jī)制,提出了新的靶向PDK1策略。本論文進(jìn)一步基于JX06的結(jié)構(gòu)骨架,設(shè)計(jì)并合成了兩系列共42個(gè)含有二硫鍵的JX06衍生物(1a-m、2a-s、3a-j)。首先測(cè)試了這些衍生物對(duì)PDK1的半數(shù)抑制濃度(IC50),得到了初步的構(gòu)效關(guān)系(SAR),發(fā)現(xiàn)了22個(gè)有顯著PDK1抑制活性的衍生物(1c-d、1f—m、2a-d、2f、2i、2j-k、2m-n、2p和3a,IC500.3μM)�？紤]到這些衍生物屬于共價(jià)抑制劑,我們引入了kinact/Ki(second-order rate constant of target inactivation)作為不可逆抑制劑抑制強(qiáng)度的定量指征對(duì)所得SAR進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果表明IC50與kinact/Ki表現(xiàn)出良好的相關(guān)性。進(jìn)一步采用免疫印跡法在細(xì)胞水平測(cè)試了優(yōu)選的22個(gè)衍生物對(duì)PDK1的抑制活性,發(fā)現(xiàn)衍生物2k和3a在細(xì)胞水平展現(xiàn)出最優(yōu)的PDK1抑制活性,且具有良好的濃度依賴(lài)性,它們?cè)谒袦y(cè)試濃度中對(duì)S232和S293兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)都顯示出了良好的抑制效果。后續(xù)的一系列藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)2k和3a是通過(guò)類(lèi)似于JX06的共價(jià)機(jī)制對(duì)PDK1產(chǎn)生抑制,并藉此改變腫瘤細(xì)胞的葡萄糖代謝路徑。通過(guò)測(cè)試優(yōu)選衍生物2k、3a及先導(dǎo)化合物JX06對(duì)PDK四種亞型的kinact/Ki值,發(fā)現(xiàn)化合物3a表現(xiàn)出最強(qiáng)效的PDK1抑制活性(IC50= 26 nM;kinact/Ki=5.14×103M-1s-1),而且相比于PDK2-4抑制活性,3a對(duì)PDK1顯示出了超過(guò)40倍的亞型選擇性,該亞型選擇性明顯優(yōu)于JX06和2k。為了解釋3a對(duì)PDK1發(fā)揮選擇性抑制的分子機(jī)制,應(yīng)用分子對(duì)接模擬出2k、3a和JX06與PDK1-4的相互作用模式,從共價(jià)反應(yīng)距離和空間適配性等方面較好的闡釋了3a選擇性抑制PDK1的原因。接下來(lái)我們考察了JX06、2k和3a在體內(nèi)外的抗腫瘤藥效。在體外抑制細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中,化合物3a對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制效果最優(yōu),且對(duì)其它兩種人正常細(xì)胞沒(méi)有明顯的抑制作用。在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,3a表現(xiàn)出了與JX06類(lèi)似的腫瘤抑制效果(TGI = 47.8%@ 80 mg/kg)。值得關(guān)注的是,3a對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重沒(méi)有任何負(fù)面影響,明顯優(yōu)于JX06,我們認(rèn)為這可能得益于其良好的PDK1亞型選擇性。本部分工作發(fā)現(xiàn)的化合物3a,作為第一代亞型選擇性PDK1不可逆抑制劑,有良好的潛力成為靶向腫瘤代謝通路研究中的工具分子或先導(dǎo)化合物。第二部分是抗耐藥金黃色葡萄球菌候選藥物開(kāi)發(fā)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)抗真菌老藥鹽酸萘替芬及其衍生物,作為金黃色葡萄球菌關(guān)鍵致病因子金黃色素合成通路催化酶CrtN的抑制劑,在感染前給藥(預(yù)防給藥)的模式中表現(xiàn)出了良好的體內(nèi)抗菌藥效。本論文以課題組前期發(fā)現(xiàn)的呋喃類(lèi)CrtN抑制劑C13為先導(dǎo)結(jié)構(gòu),在保持C13良好的體內(nèi)外藥效的前提下,通過(guò)結(jié)構(gòu)優(yōu)化來(lái)降低C13較強(qiáng)的hERG抑制毒性,并且探索在動(dòng)物藥效評(píng)價(jià)中增加感染后給藥(治療給藥)的實(shí)驗(yàn)組,試圖開(kāi)發(fā)出具有良好成藥性和應(yīng)用價(jià)值的抗耐藥金黃色葡萄球菌候選藥物。我們以C13為先導(dǎo)化合物,通過(guò)生物電子等排將C13結(jié)構(gòu)中的苯并呋喃環(huán)替換成吲哚環(huán),并依據(jù)色素抑制活性(Newman菌株)對(duì)結(jié)構(gòu)中的四個(gè)不同區(qū)域(A-D)分別進(jìn)行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化,總結(jié)歸納出相應(yīng)的構(gòu)效關(guān)系。最終發(fā)現(xiàn)一個(gè)含有端位聯(lián)苯基團(tuán)的衍生物44具有最強(qiáng)的Newman菌株色素抑制活性(IC50= 3.3 nM),化合物44在三株耐藥金黃色葡萄球菌株USA300、USA400及Mu50的色素抑制活性測(cè)試中也表現(xiàn)出了納摩爾級(jí)別的色素抑制活性。在高達(dá)0.2 mM的藥物濃度下,44對(duì)上述四株細(xì)菌的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的不良影響,證實(shí)了化合物44并不抑制細(xì)菌的生長(zhǎng),而是僅僅消減細(xì)菌的致病力。通過(guò)高效液相色譜分析給藥前后細(xì)菌金黃色素代謝通路的代謝物變化情況,證實(shí)CrtN是化合物44的作用靶標(biāo),在細(xì)菌細(xì)胞裂解液中發(fā)現(xiàn)44對(duì)CrtN具有強(qiáng)效的酶抑制活性。在過(guò)氧化氫(模擬活性氧)及人血的免疫殺傷模型中,化合物44能夠顯著提高細(xì)菌對(duì)免疫殺傷的響應(yīng),表現(xiàn)出了良好的體外抑菌效果,從功能上驗(yàn)證了化合物44是通過(guò)消減細(xì)菌致病力發(fā)揮抗菌藥效。在小鼠系統(tǒng)感染Newman菌株實(shí)驗(yàn)中,化合物44在感染前給藥和感染后給藥兩種模式中都表現(xiàn)出了良好的抗菌藥效,可顯著地降低Newman菌在小鼠腎臟、心臟和肝臟中的定植(抑菌率普遍高于95%)。針對(duì)致死劑量Newman菌供毒的敗血癥模型中,化合物44也能有效延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間。此外,體外抗真菌活性測(cè)試結(jié)果顯示,化合物44完全喪失了抗真菌活性,表現(xiàn)出選擇性的抗細(xì)菌活性。最后我們測(cè)試了化合物44對(duì)hERG鉀通道的抑制活性,結(jié)果表明44幾乎沒(méi)有hERG抑制毒性(IC5040 μM),遠(yuǎn)優(yōu)于先導(dǎo)化合物C13(IC50= 3.7 μM)。目前本課題組正在開(kāi)展化合物44對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌的體內(nèi)抗菌活性評(píng)價(jià)。已有的結(jié)果表明本論文針對(duì)C13的結(jié)構(gòu)優(yōu)化是成功的,最優(yōu)化合物44不但保持了先導(dǎo)化合物C13強(qiáng)效的體內(nèi)外抗菌活性,而且極大地改善了對(duì)hERG抑制帶來(lái)的潛在心臟毒性。在新設(shè)計(jì)的小鼠體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)中,化合物44在感染后給藥(治療給藥)的模式中依然能表現(xiàn)出良好的抗菌藥效,這也為后續(xù)的臨床前開(kāi)發(fā)提供了更有說(shuō)服力的藥效數(shù)據(jù)。本部分工作發(fā)現(xiàn)的化合物化合物44,具有更優(yōu)的藥物安全性、更合理的體內(nèi)抗菌效果,可以作為靶向細(xì)菌致病力的抗耐藥菌候選藥物進(jìn)一步深入開(kāi)發(fā)。
[Abstract]:This paper consists of two parts : the first part is the research of the non - reversible inhibitor of subtype selective pyruvate dehydrogenase kinase . The metabolic abnormality of cancer cells is one of the characteristics of tumor cell survival and proliferation . In order to explain the inhibitory activity of these derivatives on PDK1 , it was found that the inhibitory effect of these derivatives on PDK1 was better than that of PDK1 - 4 . The results showed that the inhibition of PDK1 was better than that of pacts / Ki ( second - order rate constant of target inactivation ) . In this paper , we found that there was no significant negative effect on the body weight of the experimental animals , which was obviously better than that of the drug resistant Staphylococcus aureus . The results showed that the compound 44 had the strongest inhibitory activity against the drug resistance . The results show that the compound 44 not only maintains the antibacterial activity of the leading compound C13 in vivo , but also greatly improves the potential cardiotoxicity caused by the inhibition . In the newly designed mouse body antibacterial experiment , the compound 44 has better drug safety and more reasonable in vivo antibacterial effect , and can be further developed as an anti - drug resistant candidate drug for targeting bacterial virulence .

【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R979.1

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本文編號(hào)：1426895