本文關(guān)鍵詞：特異性結(jié)合內(nèi)皮祖細胞和內(nèi)皮細胞小分子肽的篩選及其內(nèi)皮化人工血管的研究　出處：《山東大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：背景和意義心血管疾病是導致人類死亡的首要原因。通過血管移植對受損血管進行替換是治療心血管疾病的主要途徑。然而,當前合適的自體血管移植物來源有限,并且生物降解聚合物小口徑人工血管(內(nèi)徑≤5 mm)在移植后由于表面缺乏功能內(nèi)皮化容易發(fā)生血栓及內(nèi)膜增生,從而影響了長期通暢率。近年來,通過體外在聚合物人工血管表面種植自體細胞構(gòu)建組織工程血管以提高小口徑人工血管的內(nèi)皮化和長期通常率得以發(fā)展。然而,體外通過細胞培養(yǎng)種植構(gòu)建組織工程血管,在細胞收集和培養(yǎng)方面耗時、耗力、耗材,且存在較高的風險,因此利用機體天然再生機制,構(gòu)建可以自主招募內(nèi)源性細胞且具有原位血管再生潛能的人工血管成為當前研究的主要方向。天然血管中的細胞外基質(zhì)對于血管的結(jié)構(gòu)和功能有著重要的生理學功能,且內(nèi)源性的內(nèi)皮祖細胞(EPC)和內(nèi)皮細胞(EC)在新血管形成過程中扮演著重要的角色。因此,當前多種功能性的生物分子已經(jīng)被用于修飾聚合物人工血管,構(gòu)建類似于細胞外基質(zhì)的功能性人工血管表面,從而自主招募內(nèi)源性的EPC和EC。然而,這些功能性分子存在很多弊端,如缺乏對于EPC和(或)EC結(jié)合的高特異性和高親和力,從而容易導致其它不利細胞粘附在血管表面形成血栓;缺乏對于EPC和(或)EC的功能性,難以促進細胞的生長和組織的再生;體內(nèi)穩(wěn)定性較低,從而大大降低了其在體內(nèi)的功能性。One-bead one-compound(OBOC)組合文庫技術(shù)是一種高通量的化學文庫合成及篩選技術(shù),可以廣泛地用于多種生物功能性受體的配基的合成和篩選。在應(yīng)用OBOC技術(shù)篩選小分子化合物過程中,可以通過設(shè)計主要功能基團周邊氨基酸殘基不同的空間結(jié)構(gòu),從而提高篩得小分子肽對于目標靶分子結(jié)合的特異性和親和力。同時,在利用OBOC技術(shù)篩選合成小分子肽的過程中可以引入非天然氨基酸殘基并實現(xiàn)環(huán)狀結(jié)構(gòu),從而大大提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性。因此,本課題利用OBOC技術(shù),針對對EPC和(或)EC功能具有重要影響的表面整合素分子,篩選合成對EPC和(或)EC具有高特異性、高親和力、高功能性且體內(nèi)具有高結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的生物小分子肽,并將它穩(wěn)定地修飾于小口徑人工血管支架表面,構(gòu)建生物功能型人工血管。我們進一步證實該生物功能型人工血管移植動物體內(nèi)后可以快速有效的招募內(nèi)源性的EPC和(或)EC到血管移植物與血液接觸的管腔表面,同時抑制其它不利細胞和蛋白的粘附,從而提高小口徑人工血管的快速內(nèi)皮化和長期通暢率。內(nèi)容、方法和結(jié)果1.EPC和EC特異性結(jié)合小分子肽的篩選和鑒定方法:利用OBOC組合文庫技術(shù)合成篩選針對EPC和(或)EC具有高特異性和高親和力的功能性小分子肽;通過活細胞與修飾有篩得的小分子肽的樹脂球結(jié)合實驗測定篩得的小分子肽對于EPC和EC的結(jié)合的特異性;通過流式細胞技術(shù)比較篩得的小分子肽與傳統(tǒng)的GRGD對于EPC和EC的結(jié)合特異性和親和力的差異;通過表面粘附實驗進一步測定和確定篩得的小分子肽與傳統(tǒng)的GRGD對于EC的結(jié)合的特異性和親和力的差異;通過測定αvβ3抗體封閉前后篩得的小分子肽對于EPC和EC的結(jié)合能力,評估篩得的小分子肽是否確實通過細胞表面整合素αvβ3與EPC和EC結(jié)合。結(jié)果:利用OBOC組合文庫技術(shù)合成篩選了包含非天然氨基酸殘基和二硫鍵的小分子八肽LXW7(cGRGDdvc);細胞和修飾有小分子肽的樹脂球結(jié)合實驗結(jié)果證明,LXW7對于不同來源的EPC和EC具有較強的結(jié)合能力,并且不結(jié)合THP-1單核細胞,與血小板結(jié)合非常微弱;流式細胞技術(shù)測定結(jié)果顯示,與GRGD相比,LXW7具有與不同來源的EPC和EC更強的結(jié)合能力,LXW7和GRGD都不與THP-1單核細胞結(jié)合,值得關(guān)注的是,LXW7與血小板結(jié)合非常微弱,但GRGD卻與血小板有較強的結(jié)合;表面粘附實驗結(jié)果顯示,與GRGD表面相比,EC更容易在LXW7表面粘附,LXW7和GRGD表面都不支持THP-1單核細胞的粘附,血小板在LXW7表面粘附非常微弱,但在GRGD表面有較強的粘附;整合素αvβ3抗體封閉實驗顯示,αvβ3在不同來源的EPC和EC表面均有很強的表達,利用αvβ3抗體對細胞封閉之前LXW7與EPC和EC都有很強的結(jié)合,但當利用αvβ3抗體對細胞封閉之后LXW7與EPC和EC的結(jié)合均有顯著下降。這進一步確認了 LXW7是通過整合素αvβ3分子與EPC和EC結(jié)合的。2.LXW7對于EPC和(或)EC生物學功能及在體外模擬血流情況下粘附能力的影響方法:利用MTS分析測定LXW7對于EPC和EC增殖能力的影響;利用Western-blot測定LXW7對于EPC和EC功能相關(guān)的重要信號通路的影響;利用qPCR測定LXW7對于EPC分化成熟能力的影響;體外構(gòu)建血流模擬裝置,并利用其分別測定比較在血流剪切力存在的情況下EC在LXW7和纖維連接蛋白表面的滯留情況。結(jié)果:MTS測定結(jié)果顯示,與在正常表面培養(yǎng)的EPC和EC相比,在LXW7表面培養(yǎng)的EPC和EC的增殖能力均有提高,但當將EPC和EC在LXW7表面培養(yǎng)一段時間然后將EPC和EC脫離LXW7表面自行培養(yǎng)時,細胞的增殖能力與在正常表面培養(yǎng)的EPC和EC相比并無差異;Western-blot結(jié)果顯示,LXW7可以提高EC內(nèi)VEGFR2的磷酸化,從而進一步提高細胞內(nèi)ERK1/2的磷酸化,同時LXW7也可以提高EPC內(nèi)ERK1/2的磷酸化;qPCR結(jié)果顯示,利用LXW7處理后,EPC表達KDR、NOS3、CD144、vWF、JAG1、DLL1和HEY1無顯著性變化,與成熟的EC相比,EPC表達KDR偏高,其它普遍偏低。在血流剪切力存在的情況下,EC可以在LXW7表面很好地滯留,并且強于EC在纖維連接蛋白表面的滯留。3.功能型人工血管的構(gòu)建方法:利用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建人工血管支架;設(shè)計合成為影響LXW7結(jié)構(gòu)和功能且有利于化學反應(yīng)進行的LXW7衍生物;通過"click chemistry"方法將LXW7固定于人工血管支架表面;利用全反射-傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜技術(shù)和氨基酸分析技術(shù)測定LXW7在人工血管支架表面的固定情況;體外測定EC在小分子肽修飾后的人工血管支架表面的粘附、增殖和鋪展情況。結(jié)果:選取19%聚乳酸(PLLA)和5%聚己內(nèi)酯(PCL)的混合物為原料,利用靜電紡絲技術(shù)成功構(gòu)建出結(jié)構(gòu)類似于天然細胞外基質(zhì)且機械強度與天然動脈血管相似的人工血管支架;成功合成不影響LXW7功能且有利于化學反應(yīng)的LXW7生物素衍生物,并利用優(yōu)化后的"click chemistry"反應(yīng)體系將LXW7成功固定于人工血管支架表面;全反射-傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜技術(shù)(ATR-FTIR)和氨基酸分析技術(shù)測定結(jié)果顯示,LXW7已被高效地固定于人工血管支架表面;體外測定結(jié)果顯示,與未經(jīng)修飾的人工血管支架相比,LXW7修飾后的人工血管支架表面對EC的粘附有顯著的提高,對EC的生長有顯著的促進,并且支持EC的鋪展。4.功能型人工血管體內(nèi)的內(nèi)皮化和通暢率研究方法:利用Sprague-Dawley(SD)大鼠的左側(cè)頸總動脈為模型,分別在不同時間點測定LXW7表面修飾的功能型人工血管的內(nèi)皮化程度和通暢率;并通過免疫組織化學進一步分析功能型人工血管在體內(nèi)對于內(nèi)源性EPC和EC的招募程度,以及功能型人工血管自身的內(nèi)皮化速度和內(nèi)皮覆蓋率。結(jié)果:不同時間點通暢率測定結(jié)果顯示,1周時,LXW7修飾組中,6只移植物全部保持通暢(100%),而未修飾組中卻有一半已經(jīng)堵塞,只剩3只保持通暢(50%);2周時,LXW7修飾組中有5只保持通暢(83.3%),而未修飾組中只剩1只保持通暢(16.7%);6周時,LXW7修飾組中依然有5只保持通暢(83.3%),而未修飾組中只有1只保持通暢(16.7%)。血管移植物內(nèi)表面En face免疫熒光染色結(jié)果顯示,1周時,LXW7修飾后的移植物已經(jīng)有大量的細胞粘附,而未經(jīng)修飾的移植物幾乎無細胞粘附;2周時,LXW7修飾后的移植物細胞覆蓋率迅速增加并且有組織化發(fā)生,而未修飾的移植物只有少量細胞粘附;6周時,LXW7修飾后的移植物幾乎完全被細胞覆蓋并且移植物整體正在逐漸實現(xiàn)組織化,而未經(jīng)修飾的移植物細胞粘附程度相對較弱;經(jīng)過對EPC表面標記CD34和EC表面標記CD31的熒光染色分析,結(jié)果顯示,1周時,LXW7修飾后的移植物兩端已經(jīng)有大量的EC覆蓋,與此同時,移植物中部和兩端都有大量的EPC粘附,然而未經(jīng)修飾的移植物幾乎無細胞粘附;2周時,LXW7修飾后的移植物幾乎已經(jīng)完全被EC覆蓋,并且同時依舊伴隨對EPC的招募,而未修飾的移植物只有非常少量EC粘附并且缺乏對于EPC的招募功能;6周時,LXW7修飾后的移植物完全被EC覆蓋,并且沒有新招募的EPC,而未經(jīng)修飾的移植物EC覆蓋程度相對較低。人工血管移植物移植6周后,LXW7修飾后的人工血管表面有大量的微血管和(或)毛細血管生成,而未修飾的人工血管表面幾乎無新生血管生成。移植6周后,HE染色結(jié)果顯示,LXW7修飾后的人工血管具有較好通暢率,管壁只有微量血栓形成,而未經(jīng)修飾的人工血管已幾乎堵塞,有大量的血栓形成;移植6周后,對LXW7修飾后的移植物橫切面針對EC表面的標記蛋白CD31熒光染色,結(jié)果顯示,移植物的內(nèi)壁和外壁都有大量的EC覆蓋,且有大量的EC已經(jīng)遷移至血管移植物的內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)。結(jié)論本課題通過解決當前小口徑人工血管構(gòu)建過程中存在的主要問題,成功構(gòu)建功能型小口徑人工血管,并在體內(nèi)實現(xiàn)小口徑人工血管自身的快速內(nèi)皮化并獲得長期通暢率,為設(shè)計和發(fā)展功能型小口徑人工血管提供了新的思路,提高了臨床應(yīng)用的可行性,為心血管疾病的治療提供了新的手段。(1)利用OBOC組合文庫技術(shù)合成篩選得到了對EPCs和(或)ECs具有高特異性、高親和力、高功能性和高體內(nèi)穩(wěn)定性的生物功能小分子肽LXW7。(2)在血流剪切力存在的情況下,EC在修飾有LXW7的表面依然可以很好地滯留,并且強于在纖維連接蛋白表面的滯留。(3)通過優(yōu)化選擇構(gòu)建人工血管支架的聚合物材料,利用靜電紡絲技術(shù),構(gòu)建出具有與天然細胞外基質(zhì)相似、與天然動脈血管機械強度接近的人工血管支架。(4)優(yōu)化設(shè)計出穩(wěn)定高效的"click chemistry"反應(yīng)體系,將LXW7高效穩(wěn)定地固定于人工血管支架表面,成功構(gòu)建功能型人工血管。(5)體內(nèi)測定證明所構(gòu)建的功能型人工血管實現(xiàn)了體內(nèi)的快速內(nèi)皮化和長期通暢率。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R318.1
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本文編號：1424779