本文關(guān)鍵詞：硝酸釔的神經(jīng)發(fā)育毒性動物實驗及其機制研究　出處：《中國疾病預防控制中心》2015年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的：利用ITSFn神經(jīng)發(fā)育毒性評價模型,探究硝酸釔對神經(jīng)發(fā)育影響的可能作用機制,為動物實驗觀察終點提供細胞學依據(jù)。參照OECD426神經(jīng)發(fā)育毒性實驗指南,對硝酸釔的神經(jīng)發(fā)育毒性進行安全性評價,并初步探索其可能的毒性機理；豐富硝酸釔的毒理學數(shù)據(jù)并為確定釔元素的健康指導值提供理論依據(jù)。方法：1硝酸釔對ITSFn神經(jīng)發(fā)育毒性評價模型的影響及其機制的研究①采用MTT法,計算硝酸釔染毒原代細胞的IC50;②硝酸釔濃度分為四組,分別為0.55.2.75、13.7v27.5μg/mL,對照組為相應階段培養(yǎng)基。利用ITSFn神經(jīng)發(fā)育毒性評價模型,對最終誘導得到的高比例神經(jīng)元進行如下指標檢測：應用彗星試驗和流式細胞儀檢測神經(jīng)元細胞凋亡率,應用Real Time PCR方法對神經(jīng)元細胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3等凋亡相關(guān)基因進行檢測；利用免疫印跡和分光光度法測定細胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表達水平2硝酸釔對大鼠的神經(jīng)發(fā)育毒性的研究2.1硝酸釔神經(jīng)發(fā)育毒性劑量設(shè)計①大鼠急性毒性試驗：采用霍恩氏(Horn)法,以0,215,464,1000,2150 mg/kgBW劑量的硝酸釔溶液進行大鼠灌胃,灌胃量為10.0mL/(kg·BW),連續(xù)觀察14天。記錄死亡數(shù),查表求得LD50。②單一性別28天喂養(yǎng)試驗：以雌性大鼠LDso的1/10,1/20,1/40(80、40、20mg/kg/day)分別作為本試驗的高劑量,中劑量和低劑量組,對照組給與等體積的蒸餾水,連續(xù)28天,自由飲食。每周記錄大鼠體重及進食量,試驗結(jié)束時,檢測大鼠血常規(guī)、血生化等指標,進行臟器大體檢查并進行組織取材。2.2大鼠的神經(jīng)發(fā)育毒性試驗sD雌、雄大鼠按雌雄1：1的比例合籠交配,以發(fā)現(xiàn)陰栓的日期作為孕期的第0天。將孕鼠隨機分入低、中、高3個實驗組和1個對照組,每組20只,單籠飼養(yǎng),從孕期第6天至分娩后第21天(PND21)每天分別經(jīng)口灌胃孕鼠劑量為.45mg/kg BW的受試物,對照組灌胃給予相應劑量的蒸餾水。在分娩后第4天,進行窩的標準化,每窩保留4只雄鼠和4只雌鼠。斷乳后,處死母鼠,仔鼠(喂飼組)以基礎(chǔ)飼料繼續(xù)喂養(yǎng)至PND70天,另有部分仔鼠(給藥組)持續(xù)灌胃給予原劑量受試物至PND70天。仔鼠神經(jīng)發(fā)育毒性實驗動物分配數(shù)目參照OECD426推薦方法。①母鼠觀察指標：記錄母鼠妊娠期和哺乳期間的體重、剩食量并計算食物利用率,仔鼠斷乳時,檢測母鼠血常規(guī)、血生化指標,組織器官取材,稱重測定器官臟器系數(shù),HE染色鏡下觀察。對未能生產(chǎn)的母鼠進行子宮內(nèi)著床點的檢查。②仔鼠(喂飼組)觀察指標：記錄仔鼠斷乳前和斷乳后體重、斷乳后進食量并計算食物利用率,記錄仔鼠生殖相關(guān)指標(仔鼠出生成活率、仔鼠出生個數(shù)、出生雄鼠百分比、仔鼠出生體重、仔鼠4天成活率、仔鼠21天成活率)和性成熟指標、檢測仔鼠血常規(guī)、血生化指標、臟器取材稱重并計算器官臟器系數(shù),HE染色鏡下觀察,腦組織同時進行Nissl染色觀察海馬DG區(qū)錐體細胞數(shù)目。檢查仔鼠早期神經(jīng)發(fā)育指標(平面翻正反射、懸崖回避、前肢懸掛、聽覺驚愕、嗅覺定向、空中翻正反射),并在青春期和成熟早期對仔鼠的感覺功能、運動功能和認知功能進行測試。③仔鼠(給藥組)觀察指標：記錄仔鼠斷乳后體重、進食量并計算食物利用率,檢測仔鼠血常規(guī)、血生化指標、臟器取材稱重并計算器官臟器系數(shù),HE染色鏡下觀察,腦組織同時進行Nissl染色觀察海馬DG區(qū)錐體細胞數(shù)目。對成熟早期仔鼠的感覺功能、運動功能和認知功能進行測試。2.3硝酸釔神經(jīng)發(fā)育毒性機制研究取PND21天和給藥組PND70天時仔鼠海馬,對如下指標進行檢測：應用Real Time PCR方法對海馬中Bcl-2、Bax、Caspase-3、CaM、CaMK Ⅱ、CREB和BDNF等相關(guān)基因進行檢測；利用免疫印跡和分光光度法測定海馬中Bcl-2、Bax、Caspase-3、CamkⅡ、CREB和BDNF蛋白的表達水平,采用液相色譜-質(zhì)譜／質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測海馬中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量。結(jié)果1硝酸釔對ITSFn神經(jīng)發(fā)育毒性評價模型的影響及其機制的研究①隨著暴露濃度的增加,細胞生長抑制率逐漸上升,存在劑量-反應關(guān)系,統(tǒng)計計算得硝酸釔IC5o為224.16μg/mL;②彗星試驗結(jié)果未見氧化損傷,但13.7和27.5μ/mL劑量組調(diào)亡細胞數(shù)占總細胞數(shù)比例與對照組比較顯著升高(P0.05)；流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,各受試物組細胞凋亡率呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。0.55μg/mL劑量組神經(jīng)元細胞凋亡率下降,而27.5μg/mL劑量組神經(jīng)元細胞凋亡率上升,與對照組比較差異均有顯著性(P0.05)；RT-PCR和Western blot結(jié)果表明,0.55 μg/mL劑量組上調(diào)抗調(diào)亡基因Bcl-2的表達,但抑制促調(diào)亡基因Bax和Caspase-3的表達,而27.5 μg/mL劑量組則可上調(diào)Caspase-3和Bax的表達,抑制Bcl-2的表達,Bcl-2/Bax比值總體上呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢。2硝酸釔對大鼠的神經(jīng)發(fā)育毒性及其機制的研究2.1硝酸釔神經(jīng)發(fā)育毒性劑量設(shè)計①查表求得雌鼠LD50為794mg/kgBW,根據(jù)急性毒性分級屬于低毒類物質(zhì)。②28天一般毒性預實驗：40 mg/kg/day劑量組第三、四周體重和總增重低于對照組,80 mg/kg/day劑量組第二、三、四周體重和總增重低于對照組,上述差異均有顯著性(p0.05)。大鼠部分血生化、血常規(guī)指標存在顯著差異,但均在正常范圍內(nèi),不認為有生物學意義。2.2大鼠的神經(jīng)發(fā)育毒性試驗①母鼠實驗結(jié)果顯示：與對照組相比,硝酸釔對母鼠在妊娠期和哺乳期的體重、進食量及食物利用率的影響不具有統(tǒng)計學差異(p0.05)。部分血生化、血常規(guī)指標存在顯著差異,但均在正常范圍內(nèi),不認為有生物學意義。病理檢查未見異常。②喂飼組實驗結(jié)果顯示：妊娠期和哺乳期暴露受試物能夠促進雌、雄仔鼠體重的增重。PND21天時,受試物組與對照組相比差異有顯著性(p0.05),不過這種差異會隨著受試物暴露結(jié)束而消失。未見硝酸釔對仔鼠出生存活率、性別比、每窩出生個數(shù)和性成熟等繁殖和生理發(fā)育指標、總進食量、總食物利用率和海馬DG區(qū)Nissl染色陽性的細胞數(shù)目產(chǎn)生影響,病理檢查未見異常。部分血生化、血常規(guī)、臟器系數(shù)、早期神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)行為結(jié)果存在顯著性差異,但不認為有生物學實際意義。③給藥組實驗結(jié)果顯示：從PND42天開始至實驗結(jié)束,雄性45 mg/kg/day劑量組體重顯著低于對照組(p0.05)。未見硝酸釔對進食量、食物利用率、血生化、血常規(guī)和臟器系數(shù)產(chǎn)生有實際意義性的改變。一般病理和神經(jīng)病理檢查也未見異常。Morris水迷宮試驗中,雌鼠45 mg/kg/day劑量組第5天的潛伏期高于對照組且差異有顯著性(p0.05),其他神經(jīng)行為試驗,均未見受試物組與對照組比較差異有顯著性(p0.05)。2.3硝酸釔神經(jīng)發(fā)育毒性機制研究RT-PCR和Western blot結(jié)果表明,硝酸釔分別下調(diào)PND21天雄鼠5和15 mg/kg/day劑量組,上調(diào)PND21天雌鼠5、45 mg/kg/day劑量組和PND70天時雄鼠15 mg/kg/day劑量組的CaMRNA表達水平,與對照組比較差異均有顯著性(P0.05)。PND21天時,雄鼠高劑量組γ-氨基丁酸含量和雌鼠甘氨酸含量均高于對照組,差異有顯著性(p0.05)。未見硝酸釔對PND21天和PND70天雌、雄仔鼠海馬中凋亡調(diào)控相關(guān)基因和蛋白、CaMKⅡ CREB和BDNF基因與蛋白的表達水平產(chǎn)生有實際意義性的改變。結(jié)論1.首次利用ITSFn模型,對硝酸釔神經(jīng)發(fā)育影響的可能作用機制進行研究。結(jié)果表明,硝酸釔對小鼠胚胎干細胞神經(jīng)發(fā)育的影響具有雙重性。低濃度的硝酸釔可促進神經(jīng)元細胞中抗凋亡基因Bc1-2的表達,但抑制促凋亡基因BaxCaspase-3的表達,抑制細胞凋亡,高濃度硝酸釔可致神經(jīng)元細胞生長抑制率增加,并抑制細胞中Bcl-2的表達,激活Bax和Caspase-3的表達,從而誘發(fā)細胞凋亡；Bcl-2/Bax比值總體上也呈現(xiàn)出先上升再下降的趨勢,表明硝酸釔對小鼠胚胎干細胞神經(jīng)發(fā)育的影響具有劑量依賴性,提示細胞凋亡可能是硝酸釔神經(jīng)發(fā)育影響的作用機制之一。2.首次按照OECD426神經(jīng)發(fā)育毒性試驗指南對硝酸釔大鼠的神經(jīng)發(fā)育毒性進行評價,證實硝酸釔影響大鼠體重增加,這種毒作用具有暴露依賴性和可恢復性。結(jié)果顯示,本試驗條件下,通過宮內(nèi)和哺乳暴露的方式,硝酸釔能夠促進雌、雄仔鼠體重的增重,但斷乳后(停止受試物暴露),體重差異會逐漸消失。未見硝酸釔對喂飼組雌、雄仔鼠的早期神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)行為造成影響。硝酸釔在神經(jīng)發(fā)育毒性試驗大鼠的NOAEL值為45mg/kg/day,相當于釔元素的NOAEL值為14.6 mg/kg/day。3.本研究在OECD426的基礎(chǔ)上增設(shè)給藥組實驗。結(jié)果顯示,斷乳后繼續(xù)灌胃給予仔鼠宮內(nèi)暴露時相同劑量的受試物,從PND42天開始至實驗結(jié)束,雄性45 mg/kg/day劑量組體重顯著低于對照組(p0.05)。雌鼠體重表現(xiàn)出相同的趨勢,但雌鼠各劑量組、雄鼠其他劑量組與對照組比較均未見統(tǒng)計學差異(p0.05)。給藥組實驗研究提示后期持續(xù)暴露,硝酸釔存在潛在的發(fā)育毒性。4.首次開展硝酸釔對海馬中凋亡通路和Ca2+-CaM-CaMKⅡ-CREB信號通路幾種重要信號分子表達的初步研究,提示硝酸釔可以引起CaM mRNA表達水平的變化,這可能與釔離子和Ca2+內(nèi)流有關(guān)。但本試驗條件下,未見硝酸釔對PND21天和PND70天雌、雄仔鼠海馬中凋亡調(diào)控相關(guān)基因和蛋白、CaMKⅡ、CREB和BDNF基因與蛋白的表達水平產(chǎn)生有實際意義性的改變。
[Abstract]:Objective: using ITSFn neural developmental toxicity evaluation model, explore the possible mechanism of Yttrium Nitrate on neurodevelopmental effects, provide cytological evidence for animal experiments. According to the OECD426 end point developmentalneurotoxicity experimental guide on yttrium nitrate developmentalneurotoxicity safety evaluation, and explore the possible mechanism of toxicity; rich yttrium nitrate toxicological data and for identifying health guidance yttrium element value and provide a theoretical basis. Methods: 1 of the yttrium nitrate toxicity evaluation model of the effect and mechanism of ITSFn neural development using MTT method. The calculation of primary yttrium nitrate exposure cell IC50; the yttrium nitrate was divided into four groups, respectively 0.55.2.75,13.7v27.5 g/mL. The control group culture medium for the corresponding stage. Using ITSFn neural developmental toxicity evaluation model, the following measurements were performed on the final induced high proportion of neurons should be: Using neuronal cell apoptosis detection of comet assay and flow cytometry, application of Real PCR method of Bcl-2 Time neurons were detected, Bax and Caspase-3 and apoptosis related genes; spectrophotometric method for the determination of Bcl-2 in cells by Western blot, the expression level of Bax protein and Caspase-3 protein in 2 yttrium nitrate toxicity to rats 2.1 the neural development of yttrium nitrate neurodevelopmental acute toxicity of toxic dose design test in rats: the horn (Horn) method with yttrium nitrate dose of 021546410002150 mg/kgBW rats were intragastric gavage volume was 10.0mL/ (kg - BW), continuous observation for 14 days. The number of recorded deaths, obtained the look-up table LD50. single sex 28 days feeding test: female LDso rats (80,40,20mg/kg/day 1/10,1/20,1/40) were used as the test of high dose, middle dose and low dose group, the control group was given equal volume of distilled water. 緇，

本文編號：1421689