本文關鍵詞：miR-125b調控心臟成纖維細胞影響急性心梗后心室重構的實驗研究　出處：《山東大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：背景近年來,急性心肌梗死的死亡率在我國一直走高,疾病負擔日趨沉重。雖然溶栓治療、心臟介入手術等治療策略使心肌梗死預后有了較大改觀,但仍有許多病人發(fā)生梗死后心室重構,并且有許多病人最終進展為心力衰竭。急性心肌梗死后心力衰竭的主要病生機制就是心室重構,近年來,如何減緩或逆轉急性心肌梗死后心室重構已成為基礎與臨床研究的熱點。心肌梗死后后心室重構涉及多個過程,例如心肌細胞肥大,細胞外基質合成增加及沉積,血管的增生等。在心肌梗死發(fā)生的起始階段,細胞外基質合成及沉積逐漸增多,一方面，可以使心臟收縮力增強,另一方面,產(chǎn)生瘢痕可以防護心臟發(fā)生破裂,具有改善心臟功能的作用;隨著心肌梗死的發(fā)展,到了心肌梗死后期,細胞外基質大量的沈積可以引起心肌纖維化,并最終進展成為心力衰竭。因此,過度的心肌纖維化是心室重構中的重要病理改變。眾多的研究發(fā)現(xiàn),心肌梗死發(fā)生的過程中,梗死區(qū)會不間斷的出現(xiàn)細胞外基質的合成、沉積,梗死區(qū)甚至在數(shù)年后仍然能觀察到細胞外基質重塑,并且處于激活狀態(tài)。因此,探討心肌纖維化的激活機制和調控手段,可為改善心肌梗死的預后提供有效的策略。心肌纖維化發(fā)生過程中,最重要的效應細胞就是心臟成纖維細胞(cardiac fibroblasts,CFs),其增殖活化足心肌纖維化的重要環(huán)節(jié)。CFs是心臟細胞外基質蛋白的主要分泌細胞,可分化為肌成纖維細胞,從而合成及分泌更多的細胞外基質蛋白。CFs的持續(xù)增殖及分化勢必會造成心肌的纖維化發(fā)生。因此,限制CFs的增殖和分化可為減少病理性心肌纖維化提供有潛力的措施。越來越多的研究表明微小核糖核酸(micro RNA,miRNA)在心肌纖維化中發(fā)揮著重要的作用。miRNA是一類高度保守的非編碼小分子RNA,其可通過與靶基因的3'端非翻譯區(qū)(3' UTR)上的對應的靶點結合,降解或者抑制靶基因表達而發(fā)揮調控作用。miRNA不單單在心血管系統(tǒng)發(fā)育中有重要作用,而且在心臟病理生理方面也起著重要作用,如心肌肥厚、心肌缺血等。研究發(fā)現(xiàn),在先天性心臟病、心肌肥厚(生理性或病理性)及心力衰竭中均存在著miRNA表達的改變,這提示miRNA在心室重構中可能有關鍵性作用。在眾多的miRNA中,微小核糖核酸-125b(micro RNA-125b,miR-125b)的作用尤其重要。研究發(fā)現(xiàn),miR-125b在人心力衰竭的心肌組織和其它實驗動物模型心肌組織中的表達呈明顯上調水平,從而表明miR-125b可能是心肌重構的特征性分子。因此,miR-125b在心血管疾病中可能具有重要價值。但目前關于miR-125b在心肌纖維化中的機制還不清楚,值得我們深入研究。我們的研究目的就是通過體外體內實驗來探討miR-125b對CFs功能的具體調控作用,篩選其靶基因,驗證這一調控作用是否通過Wnt/β-catenin信號通路來完成。本項研究分為三個部分。第一部分目的:探討miR-125b對人CFs合成膠原、活化、增殖和遷移功能的調控作用,以及miR-125b對細胞凋亡的影響。方法:體外培養(yǎng)人CFs,分為4組:空白對照組,陰性對照組,miR-125b模擬物轉染組和miR-125b抑制物轉染組。分別將miR-125b模擬物和抑制物轉染到人CFs中,使用實時熒光定量PCR、Western blot檢測Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達水平及Western blot 檢測 α-平滑肌肌動蛋白(a-smooth muscle actin,α-SMA)(CFs 活化標志物)表達水平;使用BrdU法檢測細胞增殖情況;使用Transwell細胞遷移檢測細胞遷移能力;使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,最終明確miR-125b在CFs中的具體作用。結果:1.實時熒光定量PCR及Western blot檢測顯示,轉染miR-125b模擬物可上調CFs中Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達水平(P均0.05);轉染miR-125b抑制物則下調Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達(P均0.05)。2.Western blot 檢測顯示,miR-125b 模擬物可促進 CFs 表達 α-SMA(P0.05);轉染miR-125b抑制物則可以抑制CFs表達α-SMA(P0.05)。3.BrdU增殖檢測顯示,轉染miR-125b可促進CFs的細胞增殖(P0.05);轉染miR-125b抑制物則可抑制其細胞增殖(P0.05)。4.Transwell細胞遷移檢測顯示,轉染miR-125b模擬物后,miR-125b表達上調可增強CFs細胞遷移能力(P0.05);轉染miR-125b抑制物則使其遷移能力顯著下降(P0.05)。5.流式細胞儀檢測細胞凋亡顯示:轉染miR-125b抑制物后,CFs早期凋亡和晚期凋亡水平均明顯提高(P均0.05);轉染miR-125b模擬物后,CFs凋亡水平有所下調,但差異無統(tǒng)計學意義。結論:1.miR-125b加強CFs合成Ⅰ型和Ⅲ型膠原能力。2.miR-125b促進CFs向肌成纖維細胞轉化。3.miR-125b促進CFs細胞增殖和遷移能力。4.抑制miR-125b表達可以促進CFs細胞凋亡。第二部分目的:探索并驗證miR-125b在TGF-β1信號通路或Wnt/β-catenin信號通路上是否存在靶基因。方法:使用生物信息學算法預測miR-125b的靶基因,根據(jù)功能及文獻報道進行篩選后,使用熒光素酶實驗進行驗證。將miR-125b潛在靶基因的3'UTR克隆到雙熒光素酶報告載體psiCHECK-2中;將miR-125b潛在靶基因的3'UTR進行突變并克隆到雙熒光素酶報告載體psiCHECK-2中。最后分別把兩個質粒及miR-125b轉染入CFs,分析熒光素酶活性變化,明確miR-125b所調控的靶基因。結果:1.預測 miR-125b 候選靶基因有 MMP14、MAPK1、SFRP5、FGFR3 和 FGF15等,結合KEGG數(shù)據(jù)庫中基因功能、現(xiàn)有文獻及既往研究基礎,最終選擇SFRP5進行進一步的驗證實驗。2.轉染野生型SFRP5-3'UTR的CFs中,熒光素酶活性與空載體對照組相比降低45%左右,差異明顯(P0.05);將預測的miR-125b靶基因突變后的突變型SFRP5-3'UTR轉染入CFs中后,熒光素酶活性與空載體對照組相比無明顯差異。結論:SFRP5是miR-125b的下游靶基因。第三部分目的:體內外實驗驗證miR-125b是否通過調控SFRP5影響CFs合成膠原、活化、增殖及遷移功能及抑制miR-125b表達對心梗后心肌組織形態(tài)的影響。方法:1.在體外培養(yǎng)人CFs,分為7組:空白對照組,陰性對照組,miR-125b抑制物轉染組,miR-125b模擬物轉染組,SFRP5過表達載體轉染組,SFRP5siRNA轉染組,miR-125b模擬物+SFRP5過表達載體轉染組。分別將miR-125b模擬物和抑制物轉染入進人CFs,實時熒光定量PCR檢測SFRP5 mRNA表達;分別將miR-125b模擬物和抑制物,SFRP5過表達載體和SFRP5 siRNA,以及miR-125b模擬物+SFRP5過表達載體等分組轉染入到人CFs中,Western blot檢測SFRP5,Ⅰ型和Ⅲ型膠原及α-SMA等蛋白表達水平;BrdU法檢測細胞增殖情況;Transwell細胞遷移檢測細胞的遷移能力;流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。2.轉染組小鼠在構建心梗模型前注射入miR-125b antagomir,構建小鼠急性心肌梗死模型,觀察心肌梗死后心肌組織形態(tài)和SFRP5表達情況。結果:1.實時熒光定量PCR檢測顯示,轉染miR-125b抑制物后,SFRP5表達上調(P0.05);轉染miR-125b模擬物后,SFRP5表達下調(P0.05)。2.Western blot檢測顯示,轉染miR-125b抑制物后,SFRP5表達上調,轉染miR-125b模擬物后,SFRP5表達下調(P均0.05);轉染SFRP5過表達載體后,SFRP5表達上調,α-SMA表達受到抑制(P0.05);轉染SFRP5siRNA后,SFRP5表達下調,α-SMA表達水平則明顯提高(P0.05);轉染SFRP5過表達載體后,Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達顯著降低(P均0.05);轉染SFRP5siRNA抑制SFRP5表達后,Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達水平顯著上調(P均0.05);同時轉染SFRP5過表達載體和miR-125b模擬物時,SFRP5表達上調不顯著,α-SMA、Ⅰ和Ⅲ型膠原的表達并未受到明顯抑制。3.BrdU增殖檢測顯示,轉染SFRP5 siRNA下調其表達后,CFs細胞增殖得到促進(P0.05);轉染SFRP5過表達載體后則與miR-125b抑制物有類似作用,可以抑制CFs細胞增殖(P0.05);共轉染SFRP5過表達載體和miR-125b模擬物時,CFs細胞增殖同樣受到抑制,但與空白對照組差異并不顯著。4.Transwell細胞遷移檢測顯示,轉染SFRP5 siRNA抑制其表達,可以增強CFs細胞遷移能力(P0.05);轉染SFRP5過表達載體則可以抑制CFs細胞遷移能力(P0.05);共轉染SFRP5過表達載體和miR-125b模擬物時,CFs細胞遷移下下調,但與對照組差異無統(tǒng)計學意義。5.流式細胞儀檢測細胞凋亡顯示,轉染SFRP5過表達載體可顯著上調CFs細胞凋亡(P0.05);轉染SFRP5siRNA則有相反作用;共轉染SFRP5過表達載體和miR-125b模擬物時,CFs細胞凋亡有所上調,與對照組差異不顯著。6.HE染色顯示,假手術對照組可見心肌橫紋清晰,排列整齊,細胞核明顯,細胞無明顯腫脹;急性心肌梗死組可見多發(fā)散在的壞死灶,界限清晰,可見有明顯的成纖維細胞增生,心肌肥大,同時可見較多的纖維化;轉染入miR-125b抑制物后,急性心肌梗死的典型病理現(xiàn)象有所改善。7.Masson染色顯示,假手術組心肌組織被染成均勻紅色,可見前壁的厚度較一致,心肌組織膠原纖維少,無條索狀及融合的膠原纖維;急性心肌梗死組小鼠左心室前壁心肌梗死區(qū)心肌組織被膠原纖維取代,且顯著增多,呈條索狀,分割包繞心肌束,部分膠原纖維融合,并可見前壁變薄;急性心肌梗死組+ miR-125b抑制劑轉染組可見急性心肌梗死后典型病理現(xiàn)象改善。IPP6.0分析比較各組Masson染色結果并計算膠原容積積分進行比較,急性心肌梗死組膠原容積積分明顯高于假手術組(P0.05),急性心肌梗死+miR-125b抑制劑轉染組膠原容積積分明顯低于急性心肌梗死組(P0.05)。8.免疫組化染色后顯示,SFRP5在假手術組小鼠心肌組織具有較高的表達;與假手術組比較,急性心肌梗死組心肌組織SFRP5表達顯著下調(P0.05);急性心肌梗死+ miR-125b抑制劑轉染組心肌組織SFRP5表達明顯高于急性心肌梗死組(P0.05)。結論:1.SFRP5抑制CFs的合成膠原、向肌成纖維細胞分化、增殖及遷移能力。2.miR-125b通過抑制SFRP5,增強CFs合成膠原、向肌成纖維細胞分化、增殖及遷移能力。3.抑制miR-125b表達可以改善急性心肌梗死后心肌組織形態(tài)的病理改變。總結論:1.miR-125b促進CFs合成膠原、向肌成纖維細胞分化、增殖和遷移能力,抑制miR-125b表達可促進細胞凋亡;2.SFRP5抑制CFs合成膠原、向肌成纖維細胞分化、增殖及遷移能力,強化SFRP5表達可促進細胞凋亡;3.miR-125b通過抑制SFRP5,增強CFs合成膠原、向肌成纖維細胞分化、增殖及遷移能力;4.抑制miR-125b表達可以改善急性心肌梗死后心肌組織形態(tài)改變。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R542.22

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本文編號：1418727