本文關(guān)鍵詞：調(diào)控巨噬細胞M2型極化的長鏈非編碼RNA發(fā)現(xiàn)及小分子化合物的干預研究　出處：《浙江大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：巨噬細胞是造血系統(tǒng)中可塑性最強的免疫細胞,研究表明,巨噬細胞根據(jù)所處微環(huán)境刺激信號的不同,可極化為經(jīng)典活化型巨噬細胞(M1型巨噬細胞)和替代活化型巨噬細胞(M2型巨噬細胞),在正常發(fā)育、體內(nèi)平衡、組織修復和對病原體的免疫反應中發(fā)揮著重要的作用。作為腫瘤微環(huán)境中最為常見的免疫細胞,存在于腫瘤組織中的巨噬細胞被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細胞,越來越多的研究表明腫瘤相關(guān)巨噬細胞具有M2樣的表型,并且在腫瘤的發(fā)生和惡性演進中發(fā)揮著極重要的作用,被認為是可用于腫瘤治療的藥物作用靶細胞,但是調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細胞M2型極化的具體分子機制一直是該領(lǐng)域的研究難點,尚無突破性進展。長鏈非編碼RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個堿基的RNA分子,它們并不編碼完整的蛋白,而是以RNA的形式在細胞內(nèi)調(diào)控基因的表達水平從而影響生命活動,被認為是一個調(diào)控生命的全新"維度"。近年來已有文獻表明lncRNA在調(diào)控細胞分化中起著重要的作用,但對于其與巨噬細胞M2型極化的調(diào)控卻鮮見報道。本文將利用經(jīng)典的M2型巨噬細胞極化因子,構(gòu)建穩(wěn)定的體外M2型極化模型,應用lncRNA基因芯片技術(shù),鑒定在M2型極化過程中發(fā)揮調(diào)控作用的關(guān)鍵lncRNA,并在此基礎(chǔ)上深入研究其調(diào)控巨噬細胞M2型極化的分子機制;在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)對關(guān)鍵lncRNA及巨噬細胞M2型極化具有干預作用的小分子化合物,研究其干預作用的分子機制,探討小分子化合物對于腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響,以期從巨噬細胞M2型極化出發(fā)為干預腫瘤的發(fā)生帶來新的思路。第一部分 調(diào)控巨噬細胞M2型極化的lncRNA發(fā)現(xiàn)及其作用機制研究研究目的:本部分旨在發(fā)現(xiàn)在巨噬細胞M2型極化過程中起調(diào)控作用的lncRNA,研究其介導巨噬細胞M2型極化的分子機制以及對巨噬細胞生物學功能的影響,為干預腫瘤相關(guān)巨噬細胞M2型極化提供潛在的靶點。研究方法:本部分研究采用小鼠巨噬細胞系RAW264.7和小鼠原代巨噬細胞BMDM作為研究對象。(1)通過流式細胞術(shù)檢測經(jīng)典刺激因子IL4和IL13對巨噬細胞M2型極化的表面標記物CD206和CD209的表達影響,以考察巨噬細胞M2型極化情況;(2)在構(gòu)建穩(wěn)定模型的基礎(chǔ)上,收集不同來源巨噬細胞,不同刺激時間的樣本進行基因芯片技術(shù)分析相關(guān)差異lncRNA的表達;(3)通過siRNA技術(shù)干擾目標lncRNA的表達,通過流式細胞術(shù)和Real-time PCR技術(shù)檢測巨噬細胞M2型極化的相關(guān)標記物的表達情況;(4)Transwell小室法檢測siRNA技術(shù)干擾目標lncRNA的表達后,對腫瘤細胞運動遷移能力的影響;(5)通過管腔形成實驗檢測siRNA技術(shù)干擾目標lncRNA的表達后,對臍靜脈內(nèi)皮細胞管腔形成能力的影響;(6)Western blot法檢測siRNA技術(shù)干擾目標lncRNA的表達后,巨噬細胞M2型極化相關(guān)信號通路的變化情況。研究結(jié)果:(1)應用M2型極化誘導因子IL4或IL13誘導發(fā)生M2型極化,通過流式細胞術(shù)檢測巨噬細胞表面標記物CD206和CD209,發(fā)現(xiàn)在RAW264.7細胞和BMDM細胞中,IL4或IL13均能誘導M2型表面標記物CD206和CD209表達增加。(2)應用IL13作用于RAW264.7細胞和BMDM細胞,通過lncRNA基因芯片技術(shù)測序發(fā)現(xiàn):RAW264.7細胞中,共有55個lncRNA在不同時間點均發(fā)生5倍以上增加,BMDM細胞中共有104個lncRNA發(fā)生5倍以上增加;其中發(fā)生增加的lncRNA共有9個,數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)lncRNA-RIK可能具有調(diào)控巨噬細胞M2型極化的作用。(3)應用Real-time PCR技術(shù)檢測LPS、IL4和IL13不同因子刺激巨噬細胞發(fā)生M1型和M2型極化之后lncRNA-RIK表達水平變化,發(fā)現(xiàn)lncRNA-RIK特異性地在M2型極化過程中發(fā)生增加(在RAW264.7細胞中,IL4或IL13刺激后lncRNA-RIK表達水平分別增加8.39 ± 2.94倍和8.17 ± 3.77倍,p值分別為0.0486和0.0301;在BMDM細胞中,IL4或IL13刺激后lncRNA-RIK表達水平分別增加2.02 ± 0.31倍和3.78 ± 0.36倍,p值分別為0.0049和0.0002)。(4)通過siRNA技術(shù)干擾巨噬細胞中l(wèi)ncRNA-RIK的表達后,巨噬細胞在IL4或IL13刺激下的M2型極化受到顯著抑制(各組別p值均小于0.05);(5)通過Transwell實驗發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細胞條件培養(yǎng)基能夠促進腫瘤細胞的遷移運動能力,但是沉默lncRNA-RIK的表達后不能逆轉(zhuǎn)此作用。(6)采用管腔形成實驗發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細胞條件培養(yǎng)基能夠促進HUVEC細胞管腔形成能力,但是沉默lncRNA-RIK的表達后不能逆轉(zhuǎn)此作用。(7)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)IL4或IL13作用巨噬細胞后,M2型極化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子STAT6原型蛋白未發(fā)生改變,磷酸化化水平增加,沉默lncRNA-RIK的表達后,STAT6的磷酸化水平下降。研究結(jié)論:lncRNA-RIK通過抑制轉(zhuǎn)錄因子STAT6的磷酸化水平調(diào)控巨噬細胞的M2型極化,干擾lncRNA-RIK的表達可影響M2型巨噬細胞的促進血管生成能力,提示lncRNA-RIK可能是調(diào)控巨噬細胞M2極化的關(guān)鍵因子。第二部分 干預巨噬細胞M2型極化相關(guān)IncRNA的小分子化合物Fenretinide的發(fā)現(xiàn)及其機制研究研究目的:基于所發(fā)現(xiàn)的調(diào)控巨噬細胞M2型極化的lncRNA-RIK,我們篩選發(fā)現(xiàn)抗腫瘤候選化合物Fenretinide(4-HPR)對lncRNA-RIK的表達具有抑制作用。因此,本部分將進一步評價4-HPR對lncRNA-RIK及巨噬細胞M2型極化的調(diào)控作用,在此基礎(chǔ)上探討4-HPR抑制巨噬細胞M2型極化的分子機制,研究巨噬細胞M2型極化在4-HPR介導腫瘤預防中的作用地位,為4-HPR的臨床應用提供理論基礎(chǔ)。研究方法:本研究采用小鼠巨噬細胞系RAW264.7、原代巨噬細胞BMDM和結(jié)腸癌細胞株(HCT116,SW620和SW480)作為研究對象。(1)應用Real-timePCR技術(shù)檢測4-HPR作用巨噬細胞后,考察lncRNA-RIK表達水平變化;(2)通過流式細胞術(shù)檢測巨噬細胞M2型極化的表面標記物CD206的表達來考察4-HPR對于巨噬細胞M2型極化的影響,通過Real-time PCR技術(shù)檢測4-HPR對于巨噬細胞M2型極化標記物mRNA水平的影響;(3)采用管腔形成實驗,考察給予4-HPR作用后,M2型巨噬細胞條件培養(yǎng)基對HUVEC管腔形成的能力的影響;(4)Western blot檢測給予4-HPR作用后,巨噬細胞M2型極化相關(guān)信號通路STAT6的激活情況;(5)體內(nèi)實驗應用轉(zhuǎn)基因小鼠APCmin/+自發(fā)結(jié)腸癌的動物模型,考察4-HPR對于腸道腫瘤發(fā)生的影響;(6)通過免疫組化方法檢測4-HPR處理小鼠的腸道組織中的M2型巨噬細胞相關(guān)蛋白的表達情況;(7)通過免疫組化方法檢測4-HPR處理小鼠的腸道組織中的血管生成情況。研究結(jié)果:(1)應用Real-timePCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),刺激因子IL4和IL13可誘導lncRNA-RIK表達增加,但是4-HPR作用后lncRNA-RIK表達水平降低(IL4單用組較與4-HPR聯(lián)合應用組相比,由6.09 ± 1.83倍下降至0.12 ± 0.03倍,p=0.0051;IL13單用組較與4-HPR聯(lián)合應用組相比,由8.18 ±3.08倍下降至0.18 ±0.09倍,p=0.0020)。(2)采取兩個體外模型評價4-HPR對巨噬細胞M2型極化的抑制作用,通過流式細胞術(shù)檢測巨噬細胞表面標記物CD206,結(jié)果顯示4-HPR可明顯抑制IL4或IL13誘導的巨噬細胞細胞M2型極化標記物的表達。(3)應用Real-timePCR技術(shù)進一步發(fā)現(xiàn)4-HPR可抑制巨噬細胞M2型極化的特異性基因Fizz-1和PPAR-γ的mRNA水平。(4)為了探討4-HPR抑制巨噬細胞M2型極化的機制,首先考察活性氧簇在巨噬細胞M2型極化過程中發(fā)揮的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)還原性物質(zhì)NAC和GSH,均不能逆轉(zhuǎn)4-HPR對巨噬細胞M2型極化的抑制作用,提示4-HPR調(diào)控巨噬細胞M2型極化與經(jīng)典的氧化應激途徑無關(guān)。(5)Western Blot進一步考察調(diào)控巨噬細胞極化的經(jīng)典信號通路JAK2-STAT6信號通路發(fā)現(xiàn)4-HPR作用巨噬細胞后,可抑制轉(zhuǎn)錄因子STAT6的磷酸化水平,從而影響巨噬細胞的M2型極化。(6)采用管腔形成實驗,發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細胞條件培養(yǎng)基能夠促進HUVEC細胞管腔形成能力,給予4-HPR作用的M2型巨噬細胞條件培養(yǎng)基可抑制HUVEC管腔形成能力。(7)采用APCmin/+轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)腸道腫瘤的動物模型,檢測4-HPR的腫瘤預防作用,結(jié)果顯示20mg/kg的4-HPR可以顯著減少腸道腫瘤的數(shù)目(對照組平均腫瘤發(fā)生數(shù)目為14±8個,4-HPR給藥組為6±7個,p=0.0088)。(8)免疫組化方法檢測小鼠的腸道組織中的M2型巨噬細胞標記物CD206的表達,發(fā)現(xiàn)4-HPR處理小鼠的腸道組織中CD206的表達減少。(9)免疫組化方法檢測小鼠的腸道組織中的血管標記物CD31的表達,發(fā)現(xiàn)4-HPR處理小鼠腸道腫瘤部位的CD31表達減少。(10)免疫組化檢測Ki67的表達,發(fā)現(xiàn)4-HPR并不影響小鼠腸道腫瘤細胞的增殖;TUNEL染色檢測小鼠腸道腫瘤細胞的凋亡情況,發(fā)現(xiàn)4-HPR不引起腫瘤細胞凋亡。研究結(jié)論:篩選得到調(diào)控lncRNA-RIK表達的小分子化合物4-HPR,可抑制巨噬細胞的M2型極化,并且可以抑制轉(zhuǎn)錄因子STAT6的磷酸化水平。進一步實驗發(fā)現(xiàn)4-HPR可通過干預巨噬細胞M2型極化發(fā)揮預防腸道腫瘤的作用,提示4-HPR是一個有效抑制巨噬細胞M2型極化的小分子化合物,具有進一步研究的價值。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 Wenwen Jia;Wen Chen;Jiuhong Kang;;The Functions of MicroRNAs and Long Non-coding RNAs in Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells[J];Genomics,Proteomics & Bioinformatics;2013年05期

2 Christoph Roderburg;Jhenee Bubenzer;Michael Spannbauer;Nicole do O;Andreas Mahnken;Tom Luedde;Christian Trautwein;Jens JW Tischendorf;;Long-term survival of a HCC-patient with severe liver dysfunction treated with sorafenib[J];World Journal of Hepatology;2010年06期

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本文編號：1405125