本文關鍵詞：FAM83D上調CD44表達促進肝細胞肝癌干性及轉移能力的機制研究　出處：《浙江大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：背景:原發(fā)性肝細胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一種常見的高致死率惡性腫瘤,也是我國最主要的公共健康問題之一。雖然目前在針對HCC的早期篩查、診斷、手術技術等方面取得了明顯進步,并顯著延長了 HCC患者的生存時間和改善了生存質量,但是HCC的高轉移率和術后高復發(fā)率始終限制著總體生存率的提高。如何有效防治術后復發(fā)轉移已經(jīng)成為進一步改善HCC患者生存預后的關鍵問題�；蚪M突變和重組是HCC獲得更強異質性以及包含干細胞特性、高度耐藥性等惡性能力的原始動力,在增強HCC細胞生存能力中起重要作用。全面解讀HCC腫瘤基因組發(fā)生的突變、結構異常、染色體重構以及拷貝數(shù)變異等信息可為揭示HCC復發(fā)轉移分子機制的研究提供重要線索,并促進早診分子標記物與精準治療靶標的發(fā)現(xiàn)。目的:本研究旨在借助高通量RNA測序技術對HCC組織和相應的癌旁組織進行轉錄組的解讀,尋找與HCC發(fā)生發(fā)展密切相關的關鍵癌基因。擴大樣本重點驗證候選癌基因FAM83D在HCC患者中的表達模式以及臨床意義。體外構建FAM83D敲減細胞株,明確FAM83D在維持HCC細胞干性中的作用。最后,借助基因芯片和蛋白質譜實驗闡明FAM83D調控HCC復發(fā)轉移的潛在分子機制。材料與方法:1.通過高通量RNA測序和生物信息學分析篩選HCC組織與相應癌旁組織間的差異表達基因。2.收集150對HCC患者腫瘤組織、配對癌旁組織以及臨床病理信息,利用免疫組織化學、實時熒光定量PCR等方法驗證候選基因FAM83D在HCC組織及癌旁組織中的表達模式,分析FAM83D在HCC組織中的表達水平與患者腫瘤病理參數(shù)、生存預后之間的相關性。3.通過體外轉染FAM83D-siRNA慢病毒構建FAM83D敲減HCC細胞株,借助懸浮球細胞培養(yǎng)實驗、流式細胞儀表面蛋白表達量分析實驗、Western免疫印跡實驗檢測FAM83D對HCC細胞干性能力、腫瘤干細胞標志物表達、腫瘤干細胞擴增的影響;利用裸鼠體內成瘤實驗和細胞侵襲實驗觀察FAM83D對HCC細胞成瘤、轉移能力的影響。4.降低HCC細胞株FAM83D表達后,利用轉錄組基因芯片實驗進行差異表達基因的篩選,通過GO和KEGG分析初步探索FAM83D參與HCC細胞干性調控的潛在分子機制。5.通過信號通路小分子抑制劑抑制實驗和CD44-siRNA轉染實驗驗證CD44與MAPK、TGF-β以及Hippo通路之間的相互調節(jié)關系,利用蛋白免疫共沉淀實驗和質譜分析明確FAM83D調控上述信號通路的關鍵上游分子。結果:1.通過對10對HCC樣本患者的高通量RNA測序,共篩選得到HCC組織及癌旁組織間差異表達基因544個(倍數(shù)改變2,P0.01),其中321個過表達基因,223個為低表達基因。FAM83D在9對HCC樣本中表達水平顯著增高,平均表達增高倍數(shù)超過8倍。2.在擴大驗證的150對HCC樣本中,qRT-PCR和免疫組織化學實驗結果證實FAM83D在HCC組織中的表達水平顯著高于配對癌旁組織(P0.01)。高表達FAM83D與HCC患者惡性腫瘤生物學特征正相關,如腫瘤低分化、血清高AFP水平、門靜脈侵犯、腫瘤數(shù)目3等。與FAM83D低表達組相比,FAM83D高表達患者擁有更高的肝移植術后腫瘤復發(fā)率和更短的無瘤生存時間。3.體外細胞干性實驗證實HCC細胞株敲減FAM83D后,顯著抑制了 CD44s和CD44v分子的表達以及懸浮球形成能力。體內動物實驗發(fā)現(xiàn)下調FAM83D后可顯著抑制HCC細胞株的成瘤能力、腫瘤轉移能力以及肺克隆能力。4.轉錄組基因芯片結果提示FAM83D下調后可引起1565個基因出現(xiàn)差異表達(倍數(shù)2,P0.01),主要分布于MAPK、TGF-β以及Hippo等信號通路。敲減FAM83D表達后,ERK1/2、Smad2磷酸化水平下降,YAP表達水平受到抑制,YAP磷酸化水平相對增高。5.MAPK、TGF-β以及Hippo信號通路抑制后,可顯著下調CD44分子的表達;干擾CD44表達后,ERK1/2、Smad2磷酸化、YAP表達水平下降,YAP磷酸化水平相對增高,提示CD44與上述信號通路存在互相調節(jié)作用。6,6.蛋白免疫共沉淀實驗和質譜分析,發(fā)現(xiàn)RAP1為FAM83D調控MAPK、TGF-β以及Hippo信號通路的關鍵上游分子。結論:1.相對于癌旁組織,FAM83D在HCC組織的表達水平明顯升高,并與惡性腫瘤生物學行為和不良預后相關。2.敲減FAM83D可顯著抑制CD44分子的表達和HCC細胞株的干性、成瘤、轉移能力,提示FAM83D可能為HCC精準治療的新靶標。3.MAPK、TGF-β以及Hippo信號通路是FAM83D參與調控CD44分子表達和HCC發(fā)生發(fā)展的潛在分子機制。
[Abstract]:BACKGROUND : Primary hepatocellular carcinoma ( HCC ) is one of the most common malignant tumors in HCC and is one of the most important public health problems in HCC . Conclusion : 1 . The expression level of MAPK , TGF - 尾 and Hippo in HCC cell line decreased and the expression level of YAP decreased . The expression level of MAPK , TGF - 尾 and Hippo signal pathway were significantly inhibited .

【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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本文編號：1384294