本文關鍵詞：初級聽覺皮層預測相關神經機制　出處：《第三軍醫(yī)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：及時地對環(huán)境信息做出合適的行為反應是動物在進化過程中獲得的一項基本能力,其中一個很重要的方面就是動物基于過去新近感覺經驗,提煉出規(guī)律,進而根據這個規(guī)律來預測即將到來的感覺信息。這種預測對動物的認知、決策以及行為調整都有重要的影響。比如,對于那些能穩(wěn)定誘發(fā)動物行為反應的感覺信息,在連續(xù)間隔相同時間的一串刺激過后,動物通常會在相應的時間點上繼續(xù)之前的行為應答。此外,患有精神分裂癥、焦慮癥等精神心理疾病的病人,他們的預測能力不論在腦活動的表現上,還是神經心理的檢測上都表現出不足。然而,對于哪些神經環(huán)路和腦區(qū)是編碼預測信號和產生預測行為所必須的,我們幾乎還一概不知。而這些信息也許能揭示出一些他們所患疾病的神經病理機制。雖然對于編碼即時感覺刺激的新皮層神經環(huán)路的研究已經有許多,但這些環(huán)路在預測即將到來的感覺信息當中的作用卻還知之甚少。因此,我們用在體雙光子細胞成像技術、光纖記錄技術和光遺傳興奮抑制技術對小鼠初級聽覺皮層的活動進行了記錄和操控,試圖解析其活動在預測信號和預測行為產生中所起的作用。研究目標:1.探測一連串規(guī)律聲音刺激后,初級聽覺皮層的預測信號及其行為學表征;2.觀測初級聽覺皮層節(jié)律性聲音預測信號與小鼠預測行為之間的因果關系;3.探索聽覺丘腦在小鼠節(jié)律性聲音預測行為產生中是否必須。研究方法:1.初級聽覺皮層雙光子鈣成像我們使用高敏感度的熒光鈣離子指示劑Cal-520酯類分子來標記初級聽覺皮層,使得皮層內某一區(qū)域的細胞群體被標記上鈣染料。鈣染料注射后一個小時即可進行雙光子成像,且能持續(xù)長達8個小時。在整個實驗過程中,小鼠的體溫被保持在36.5 37.5°C。對頭部固定的清醒小鼠進行雙光子成像實驗之前,小鼠需要先被訓練以適應頭部固定的方式,訓練時間為3-5天。2.行為學任務我們發(fā)展了一個簡單的聲音與舔水行為相偶聯的行為學任務。在每次聲音刺激(白噪音,76分貝,時長100毫秒)過后100毫秒,實驗系統都會提供時長為20毫秒的水。小鼠在訓練的過程中需要學會在聲音刺激和水供之間建立聯系,進而能夠在聽到聲音后一段很短的時間內進行舔水行為。當小鼠的這種偶聯反應成功率超過80%,則被視為訓練成功,用于實驗。3.光纖與行為學同步記錄記錄光纖放置在皮層硬腦膜表面,并用牙科水泥固定于顱骨。為了激活熒光染料分子(OGB-1 AM),光纖尖端處會持續(xù)的發(fā)射出微弱激光。并且,被激發(fā)出來的熒光也是被同一根光纖收集,最后通過鈣信號表現出來。同時,小鼠的舔水行為會被紅外相機(采樣率:30 Hz)同步記錄下來。4.光遺傳學激活和抑制在進行光遺傳學實驗之前,興奮性的轉基因動物Thy1-ChR2-YFP或者注射了光遺傳學相關的病毒的動物需要先進行行為學訓練。實驗時,在麻醉狀態(tài)下,兩根光纖被置于小鼠雙側聽覺皮層的第5層或者內側膝狀體表面。麻醉過后至少兩小時再開始進行小鼠行為學實驗。光刺激由473納米的藍光或者593納米的黃光組成,時長100毫秒。每次光刺激過后100毫秒,實驗系統都會提供時長為20毫秒的水。研究結果:1.聽皮層神經元節(jié)律性聲音預測信號的檢測1.1在麻醉和清醒狀態(tài)下,聽皮層第2/3層神經元節(jié)律性聲音預測信號的檢測我們首先用鈣染料Cal-520 AM對初級聽覺皮層第2/3層神經元進行雙光子鈣成像實驗,觀測神經元的鈣活動。對單個神經元同步的電生理和鈣活動記錄表明,在我們的實驗條件下,鈣染料Cal-520 AM能夠以接近100%的成功率反映出神經元的單個動作電位發(fā)放。進而我們在一連串規(guī)律白噪音刺激(時長100毫秒,聲強76分貝,刺激間隔2秒)之前,之中和之后都記錄了清醒或麻醉小鼠的初級聽覺皮層第2/3層神經元的鈣活動。我們發(fā)現在最后一次聲音刺激過后,在與之前聲音刺激相應的時間間隔點,大約15%(麻醉狀態(tài))或者21.5%(清醒狀態(tài))的神經元會再活動一到三次,就像仍有聲音刺激一般(實際沒有)。我們將此類在期待的時間點產生的活動稱為“回聲響應”。將聲音刺激的間隔改為4秒后,仍有部分神經元表現出回聲響應。與此相反的是,當將聲音刺激的時間間隔變得不固定(2秒和3秒交替變化)之后,神經元的回聲響應消失。除了2秒和4秒的時間間隔外,我們還測試了間隔為1秒,3秒,6秒和10秒的聲音刺激。我們發(fā)現間隔為3秒時,一連串的聲音刺激能引發(fā)出部分神經元的回聲響應,而間隔為1秒,6秒和10秒的聲音刺激這不能。另外,除了白噪音刺激外,我們還測試了純音刺激。我們發(fā)現我們所測試的不同聲強的所有純音都能引發(fā)回聲響應,表明回聲響應的發(fā)生不依賴于特定的聲音類型和聲強。并且,我們還分別測試了數目為5次,10次或30次的聲音刺激,發(fā)現聲音刺激的數目至少要為10次才能引發(fā)回聲響應�？傊�,在麻醉和清醒狀態(tài)下,初級聽覺皮層第2/3層神經元都存在節(jié)律性聲音預測相關信號。1.2.聽皮層第5層和第4層神經元節(jié)律性聲音預測信號的檢測為了實現對深層神經元的清晰成像,我們通過僅在腦區(qū)深部注射鈣染料的方式來減少淺層神經組織的熒光。鈣成像實驗局限于初級聽覺皮層第5層神經元,我們發(fā)現約33.5%的第5層神經元在一連串間隔2秒的聲音刺激后表現出了回聲響應。我們接著觀測了初級聽覺皮層第4層共13個動物1934個神經元,我們發(fā)現僅有約8%的神經元在一串規(guī)律聲音刺激后表現出了回聲響應。2.聽皮層節(jié)律性聲音預測性信號的行為學表征為了探索小鼠初級聽覺皮層預測信號的行為學表征,我們發(fā)展了一個簡單的聲音與舔水行為相偶聯的行為學任務。訓練成功的小鼠會在每次聲音刺激(白噪音,76分貝,時長100毫秒)過后一段很短的時間內進行舔水行為。于是我們用一串間隔相同時間的白噪音刺激(間隔3秒或4秒,10次)來進行行為學測試。我們發(fā)現在聲音刺激結束后相應的時間間隔點(3秒或4秒),所有小鼠都會再多舔水一次,出現了預測性舔水行為,即回聲舔水反應。與初級聽覺皮層細胞水平上的回聲反應相類似,五次連續(xù)的聲音刺激不能引發(fā)回聲舔水反應。于是我們同步記錄了初級聽覺皮層的鈣信號和小鼠的舔水行為,同時作為對照,我們也同步記錄了尾側體感皮層的鈣信號。我們發(fā)現98%±1%的聲音本身引發(fā)的舔水行為和84%±7%的預測性回聲舔水行為與初級聽覺皮層的鈣信號相關。與之相對應的是,初級聽覺皮層94%±4%的聲音反應和88%±2%的回聲反應與小鼠對聲音本身的舔水反應和預測性回聲舔水反應相關。根據信號檢測理論分析,大約80%的回聲舔水反應能夠被初級聽覺皮層的回聲反應準確預測。相反,尾側體感皮層的鈣信號與聲音引發(fā)的舔水行為和預測性舔水行為都沒有相關性。因此,小鼠的預測性回聲舔水行為與初級聽覺皮層預測信號高度相關。3.聽皮層活動在節(jié)律性聲音預測性行為中的關鍵作用研究3.1.光遺傳抑制初級聽覺皮層導致小鼠節(jié)律性聲音預測行為被抑制為了驗證初級聽覺皮層的活動在產生預測性回聲舔水反應中的必要性,我們進行了兩種不同的光遺傳抑制實驗。第一種方式是我們通過興奮光激發(fā)的外向質子泵古紫質(ArchT)將聽覺皮層的興奮性神經元的活動進行抑制。與對照組相比,抑制組小鼠的回聲舔水行為顯著減少,僅僅略高于自發(fā)舔水的發(fā)生率。第二種方式則是利用重組酶系統特異性的使得初級聽覺皮層內小清蛋白陽性的抑制性神經元表達二型離子通道視紫質(ChR2),進而通過興奮這些小清蛋白陽性神經元來達到抑制初級聽覺皮層的活動。同樣,抑制組小鼠的回聲舔水行為顯著減少,幾近于自發(fā)舔水的發(fā)生率。因此,初級聽覺皮層的活動對于小鼠預測性回聲舔水反應而言是必須的。3.2.光遺傳興奮初級聽覺皮層可誘發(fā)小鼠的節(jié)律性聲音預測行為我們接著測試了是否直接興奮初級聽覺皮層就能觸發(fā)小鼠的舔水行為。因為初級聽覺皮層第5層是主要的輸出層,并且前面的實驗也證實了第5層神經元存在回聲反應。因此我們在第5層神經元特異性表達二型離子通道視紫質(ChR2)的轉基因小鼠中進行了實驗。對于訓練過的轉基因小鼠,用藍色激光雙側激活初級聽覺皮層第5層即可替代聲音刺激觸發(fā)小鼠的舔水行為,而對于未訓練的轉基因小鼠或者訓練過的野生型小鼠則都沒有效果。重要的是,在一串連續(xù)規(guī)律的藍色激光刺激后,訓練過的轉基因小鼠出現了預測性回聲舔水行為。在部分小鼠中,我們同步刺激(第5層)并記錄初級聽覺皮層的活動,以及小鼠的舔水行為。我們發(fā)現由藍色激光刺激引起的舔水行為和預測性回聲舔水行為都與初級聽覺皮層的活動高度相關。另外,我們也測試了第二種興奮聽覺皮層的光遺傳手段:注射興奮性光遺傳學病毒到初級聽覺皮層。同樣的,激光刺激引發(fā)的初級聽覺皮層興奮觸發(fā)了小鼠的舔水反應和預測性回聲舔水反應�？傊�,這些結果表明通過光遺傳的方式興奮一部分初級聽覺皮層的神經元即可觸發(fā)小鼠的預測性回聲舔水反應。4.節(jié)律性聲音預測性行為不依賴于聽覺丘腦的活動用光纖記錄群體細胞鈣信號的方式,我們在聽覺丘腦腹側和背側均記錄到穩(wěn)定的對聲音的反應。而當在一串間隔4秒的規(guī)律聲音刺激后,聽覺丘腦的這兩個亞區(qū)都沒有顯示出回聲反應。我們又進一步用光遺傳抑制的方式在聲音刺激后八秒抑制了雙側聽覺丘腦的活動,發(fā)現對小鼠的回聲舔水行為的發(fā)生沒有顯著性影響。因此,我們的結果表明,聽覺丘腦的活動對于小鼠回聲舔水行為的產生不是必須的。研究結論:1.初級聽覺皮層第2/3,第4和第5層神經元編碼節(jié)律性聲音預測信息;2.初級聽覺皮層的節(jié)律性聲音預測信息是產生節(jié)律性聲音預測行為的關鍵;3.聽覺丘腦對于節(jié)律性聲音預測行為的產生不是必須的。
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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R338.3

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1 李景程;初級聽覺皮層預測相關神經機制[D];第三軍醫(yī)大學;2017年

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