本文關(guān)鍵詞：卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫繼發(fā)卵巢纖維化的機(jī)制研究　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫,又稱巧克力囊腫,簡(jiǎn)稱巧囊,是一種具有"惡性行為"的良性疾病,它會(huì)造成盆腔粘連、排卵障礙、卵子生成障礙、影響胚胎種植等,從而引起不孕。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫會(huì)降低IVF周期中卵巢對(duì)促排卵藥物的反應(yīng),使藥物用量增加,發(fā)育卵泡數(shù)減少,獲卵數(shù)減少。本研究通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析近5年在本院生殖中心行體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)的盆腔子宮內(nèi)膜異位癥患者,比較伴與不伴卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能、獲卵數(shù)、受精率、卵裂率、胚胎數(shù)、胚胎種植率、臨床妊娠率及流產(chǎn)率的影響,分析卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫患者影響其IVF治療結(jié)局的因素,并建立預(yù)測(cè)模型。卵巢纖維化主要表現(xiàn)為卵巢包膜增厚、間質(zhì)纖維結(jié)締組織增多,卵泡減少或消失。研究發(fā)現(xiàn)卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫囊壁的纖維化程度要明顯高于卵巢畸胎瘤,纖維化相關(guān)指標(biāo)如膠原蛋白Ⅰ型(collagen Ⅰ,Col Ⅰ)、肌動(dòng)蛋白α(Alpha-smooth muscle actin,a-SMA)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinases 2,MMP2)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子 1(tissue inhibitors of matrix metalloproteinases 1,TIMP1)和 TIMP2 等表達(dá)要顯著性高于成熟畸胎瘤囊壁。研究進(jìn)一步檢測(cè)了 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1(transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)在卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫壁的表達(dá),同時(shí)發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞能特異合成TGF-β1。通過(guò)體外培養(yǎng)子宮內(nèi)膜來(lái)源的干細(xì)胞,評(píng)估TGF-β1對(duì)子宮內(nèi)膜來(lái)源的干細(xì)胞纖維化的作用,并檢測(cè)TGF-β1/Smad通路中的相應(yīng)因子的變化,從而探索卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫囊壁纖維化的可能機(jī)制。另外,本研究發(fā)現(xiàn)卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫患者的卵丘顆粒細(xì)胞凋亡率明顯升高,并對(duì)卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫患者成熟卵泡的卵泡液行microRNA高通量測(cè)序,發(fā)現(xiàn)有7個(gè)let-7家族明顯上調(diào),并探索TGF-β1與let-7家族的關(guān)系,證實(shí)了卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫卵泡微環(huán)境的改變,推測(cè)了卵母細(xì)胞質(zhì)量下降的可能原因。第一部分卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫合并不孕患者行IVF-ET治療結(jié)局影響因素探討——五年數(shù)據(jù)分析目的:比較卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫與其他盆腔子宮內(nèi)膜異位癥患者的卵巢儲(chǔ)備功能,以及對(duì)IVF-ET治療的獲卵率、受精率、優(yōu)胚率以及妊娠結(jié)局的影響,并探討影響卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫患者IVF-ET治療結(jié)局的主要因素,為臨床診療提供一定的參考。材料與方法:選取2011年1月至2015年12月因盆腔子宮內(nèi)膜異位癥在我院生殖中心行IVF-ET的≤38歲患者共619例,其中卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫患者398例,其他盆腔子宮內(nèi)膜異位癥221例。所有IVF-ET周期均行促排卵治療,卵母細(xì)胞收集后2～6小時(shí)內(nèi)完成授精。胚胎評(píng)分系統(tǒng)按卵裂球質(zhì)量和對(duì)稱性分為4級(jí)。胚胎凍融技術(shù)在2011～2012年均采用經(jīng)典TESTART's慢速冷凍和快速?gòu)?fù)蘇方法,2013年開始逐漸采用玻璃化冷凍和解凍。鮮胚移植在取卵后3天評(píng)估胚胎質(zhì)量和患者情況,每周期移植胚胎數(shù)≤3個(gè),胚胎常規(guī)移植于宮腔中段。冷凍胚胎移植內(nèi)膜準(zhǔn)備分為自然周期、小劑量Gn促排周期以及激素替代周期。胚胎移植后第12天血β-hCG檢測(cè)確定是否妊娠,移植后第35天B超檢查見孕囊定義為臨床妊娠。使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù),用單樣本Kolmogorov-Simimov檢驗(yàn)有無(wú)正態(tài)分布,計(jì)量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,采用t檢驗(yàn)比較,計(jì)數(shù)資料使用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,理論頻數(shù)1時(shí),采用Fisher確切概率法;相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析,初步篩選出可能對(duì)卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫患者的IVF-ET治療結(jié)局有意義的參數(shù);以是否妊娠為因變量(Y=0,1),以初步篩選的參數(shù)為自變量,采用逐步回歸法建立二項(xiàng)分類Logistic回歸模型篩選出有意義的因素,以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1、卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫組的不孕年限少于其他盆腔子宮內(nèi)膜異位癥,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫組的竇卵泡數(shù)少于其他子宮內(nèi)膜異位癥,兩個(gè)年齡組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);≤30歲的基礎(chǔ)FSH兩組無(wú)差異,但31～38歲組的基礎(chǔ)FSH卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫組要明顯高于其他盆腔子宮內(nèi)膜異位癥組(P0.05)。2、IVF-ET治療中,≤30歲組和31～38歲組的卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫組的獲卵數(shù)、2PN胚胎數(shù)(P0.01),≤30歲組的2PN優(yōu)胚數(shù)(P0.05)都要少于其他盆腔子宮內(nèi)膜異位癥組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;兩組的受精率、卵裂率、2PN優(yōu)胚率均無(wú)差異;胚胎種植率、臨床妊娠率及流產(chǎn)率兩組也均無(wú)差異。3、卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫患者中首次移植成功組與治療失敗組(包括首次移植后未妊娠與無(wú)胚胎可移)相比較,妊娠組的竇卵泡數(shù)、獲卵數(shù)、2PN胚胎數(shù)、2PN優(yōu)胚數(shù)明顯多于治療失敗組(P0.01),基礎(chǔ)FSH低于治療失敗組(P0.05),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將各參數(shù)與治療有無(wú)成功行Pearson相關(guān)分析,不孕年限、竇卵泡數(shù)、獲卵數(shù)、2PN胚胎數(shù)與2PN優(yōu)胚數(shù)均與治療有無(wú)成功相關(guān),除不孕年限僅與2PN優(yōu)胚數(shù)相關(guān)外,余各因素間都存在相關(guān)性。將這5個(gè)因素采用逐步回歸法建立二項(xiàng)分類Logistic回歸模型,竇卵泡數(shù)與2PN優(yōu)胚數(shù)是卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫患者IVF-ET是否成功的關(guān)鍵因素。將2個(gè)關(guān)鍵因素及其彼此的回歸系數(shù)建立預(yù)測(cè)卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫患者IVF-ET治療結(jié)局的概率模型:P=1/1+exp(0.870-0.088×(竇卵泡數(shù))-0.432×(2PN優(yōu)胚數(shù))),繪制此模型預(yù)測(cè)率的受試者工作特征(ROC)曲線,模型ROC曲線下面積為0.734,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),其95%可信區(qū)間為(0.684～0.783)。4、卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫手術(shù)組有383例,非手術(shù)組15例,兩組平均年齡無(wú)顯著差異,手術(shù)組術(shù)前卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫直徑明顯大于非手術(shù)組(4.1cm vs.2.2cm,P0.001),手術(shù)組的竇卵泡數(shù)明顯多于非手術(shù)組(6.9vs.5.5,P=0.017),手術(shù)組的獲卵數(shù)、胚胎數(shù)、優(yōu)胚數(shù)均多于非手術(shù)組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能與非手術(shù)組例數(shù)過(guò)少以及兩組術(shù)前狀態(tài)差異有關(guān)。結(jié)論:子宮內(nèi)膜異位癥會(huì)降低IVF-ET的治療結(jié)局,但如存在卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫會(huì)明顯降低卵巢儲(chǔ)備功能從而影響IVF-ET治療的結(jié)局。卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫本身還是手術(shù)本身更不利于卵巢儲(chǔ)備功能目前尚無(wú)定論,卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫患者需要根據(jù)年齡、卵巢功能、是否生育、卵巢囊腫大小等盡早制定治療方案,盡可能保護(hù)卵巢功能。第二部分卵巢子宮內(nèi)膜異位病灶周圍卵巢組織纖維化及其機(jī)制研究目的:研究通過(guò)比較卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫和成熟畸胎瘤的囊腫壁的組織學(xué)特點(diǎn)以及分子學(xué)特征,周圍卵巢組織的纖維化程度,提出卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫囊壁為內(nèi)異病灶周圍卵巢組織纖維化形成的假說(shuō),并探索TGF-β1在卵巢子宮內(nèi)膜異位病灶的表達(dá)及其周圍卵巢組織纖維化的作用。材料與方法:1、本研究共招募了2014年11月至2015年12月間71例因卵巢囊腫入院行腹腔鏡手術(shù)患者,其中卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫42例,成熟畸胎瘤29例。所有患者均行腹腔鏡下卵巢囊腫剝除術(shù),術(shù)后用剪刀獲取囊腫壁上約1×1 cm2的組織,行HE染色體和Masson染色觀察囊壁纖維化程度。2、采用RT-qPCR檢測(cè)囊壁組織的ECM沉積和降解平衡指標(biāo)如TIMP1、TIMP2、MMP2纖維化相關(guān)指標(biāo)包括Col Ⅰ、α-SMA、CTGF等;通過(guò)IHC和Western Blotting檢測(cè)比較TGF-β1在卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫囊壁和成熟畸胎瘤囊壁上的表達(dá)。3、通過(guò)FISH檢測(cè)卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫中TGF-β1 mRNA的合成部位。4、采用RT-qPCR檢測(cè)了卵巢子宮內(nèi)膜異位病灶的緊鄰與遠(yuǎn)離卵巢組織TGF-β1及其他纖維化相關(guān)基因。結(jié)果:1、相同臨床特征的患者卵巢子宮內(nèi)異囊腫囊壁較成熟畸胎瘤囊壁纖維化明顯,HE染色及Masson染色可看到更多的纖維化表現(xiàn)。RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫囊壁中,ECM沉積和降解平衡指標(biāo)如TIMP1、TIMP2、MMP2以及纖維化相關(guān)指標(biāo)包括Col Ⅰ、α-SMA、CTGF等表達(dá)顯著性高于成熟畸胎瘤囊壁。2、TGF-β1特異性表達(dá)在卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫囊壁子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞中,而成熟畸胎瘤囊壁以及緊靠囊腔表面的上皮細(xì)胞均不表達(dá)TGF-β1;卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫囊壁的TGF-β1蛋白表達(dá)水平明顯高于成熟畸胎瘤囊壁;FISH檢測(cè)也提示子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞可特異性合成TGF-β1。3、緊鄰卵巢子宮內(nèi)膜異位病灶的卵巢組織TGF-β1較遠(yuǎn)離病灶的卵巢組織表達(dá)升高,ColⅠ、α-SMA、CTGF表達(dá)亦升高(P0.01),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,纖維化程度升高,說(shuō)明與卵巢子宮內(nèi)膜異位病灶相鄰越近,卵巢組織纖維化程度越顯著,推測(cè)卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫囊壁為高度纖維化的卵巢組織形成。結(jié)論:卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫的子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞合成和分泌TGF-β1,并積聚于周圍的卵巢組織,打破細(xì)胞外基質(zhì)沉積與降解平衡,導(dǎo)致周圍卵巢組織纖維化形成囊壁及與鄰近卵巢組織粘連形成。由于粘連形成,在囊腫剝除手術(shù)中容易帶走正常卵巢組織,從而進(jìn)一步降低卵巢儲(chǔ)備功能。因此,如何保護(hù)卵巢功能是目前卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫治療的爭(zhēng)論焦點(diǎn)之一。阻斷病理性的TGF-β1表達(dá),抑制內(nèi)異病灶周圍的卵巢組織纖維化形成是研究的主要方向之一。第三部分卵巢子宮內(nèi)膜異位病灶繼發(fā)卵巢纖維化影響卵泡微環(huán)境的作用途徑探索目的:本研究探索TGF-β]/Smad通路的激活在卵巢子宮內(nèi)膜異位病灶周圍卵巢組織纖維化進(jìn)程中的作用,并通過(guò)體外試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證TGF-β1引起纖維化的作用途徑。另外研究還結(jié)合子宮內(nèi)膜異位癥患者卵丘顆粒細(xì)胞凋亡率升高的現(xiàn)象,從分子和基因?qū)用嫜芯縏GF-β1升高與卵泡微環(huán)境改變的可能關(guān)系,為這類患者卵巢功能的保護(hù)性治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和思路。材料與方法:1、將卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫囊壁樣本行HE染色,Masson染色和免疫組化檢測(cè),檢測(cè)TGF-β1以及TGF-β1/Smad通路上各因子的表達(dá)。2、本研究獲取在我院生殖中心婦產(chǎn)科行子宮切除術(shù)或子宮內(nèi)膜活檢術(shù)患者的子宮內(nèi)膜,經(jīng)過(guò)對(duì)子宮內(nèi)膜來(lái)源的干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定,將干細(xì)胞與10 ng/ml TGF-β1共培養(yǎng),檢測(cè)干細(xì)胞上纖維化指標(biāo)及TGF-β1/Smad通路的組成部分相關(guān)因子的表達(dá)。3、獲取卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫合并不孕以及管性因素行IVF-ET的患者的卵丘顆粒細(xì)胞,測(cè)定并比較顆粒細(xì)胞凋亡率,明確卵巢子宮內(nèi)膜異位患者卵泡微環(huán)境的改變。4、獲取來(lái)自于6例行IVF治療的患者的卵泡液,其中3例為卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫患者,另3例為輸卵管梗阻患者,提取RNA后行microRNA高通量測(cè)序。5、根據(jù)microRNA高通量測(cè)序結(jié)果,選擇293T細(xì)胞與TGF-β1+/-TGF-β1抑制劑SB-431542共培養(yǎng),RT-qPCR測(cè)定let-7家族microRNA的變化。結(jié)果:1、將卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫囊壁樣本行HE染色,Masson染色和免疫組化檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):TGF-β1,TGF-βR1,α-SMA,ColⅠ和CTGF免疫組化染色陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域,與Masson染色纖維化區(qū)域相同。同時(shí),P-Smad2、P-Smad3,Smad2/3、Smad2、Smad3和Smad4的表達(dá)區(qū)域與TGF-β1,TGF-βR1,和纖維化表達(dá)區(qū)域相同。2、體外培養(yǎng)子宮內(nèi)膜細(xì)胞來(lái)源的干細(xì)胞,通過(guò)添加TGF-β1共培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞中的纖維化相關(guān)因子如ColⅠ、αSMA,CTGF和FN基因表達(dá)增加,并與作用時(shí)間呈正相關(guān);同時(shí),ColⅠ、CTGF、αSMA和MMP2的蛋白表達(dá)亦增加,與作用時(shí)間也呈正相關(guān)。此外,TGF-β1/Smad通路中的相應(yīng)因子,如Smad2、P-Smad2、Smad3、P-Smad3被激活,在TGF-β1作用初始階段即升高。3、卵泡液microRNA(簡(jiǎn)稱miRNA)高通量測(cè)序提示卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫患者卵泡液中miRNAlet-7家族共有7個(gè)miRNA,分別為hsa-let-7f-5p、hsa-miR-98-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7g-5p和hsa-let-7c-5p,表達(dá)較管性因素者顯著上調(diào)。分析文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)let-7g可以誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率升高,使卵泡閉鎖,改變卵泡微環(huán)境。4、卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫組的年齡與管性因素組無(wú)明顯差異,但獲卵數(shù)要明顯少于管性因素組,卵丘顆粒細(xì)胞的凋亡率要明顯高于管性因素組(37.2%vs.9.2%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。5、僅TGF-β1處理后293T細(xì)胞let7a、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g和miRNA-98表達(dá)均顯著上調(diào),而經(jīng)過(guò)TGF-β1抑制劑SB-431542作用后,let7家族上調(diào)被抑制,說(shuō)明TGF-β 1可能參與了 let7家族的表達(dá)上調(diào)。結(jié)論:TGF-β1/Smad信號(hào)通路在卵巢子宮內(nèi)膜異位病灶周圍卵巢纖維化形成中發(fā)揮著重要作用。通過(guò)對(duì)卵泡液microRNA高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),卵泡液中有7個(gè)let-7 miRNA表達(dá)異常上調(diào);進(jìn)而推測(cè)卵巢纖維化過(guò)程中TGF-β1信號(hào)通路激活開放,上調(diào)了let-7家族,使卵丘顆粒細(xì)胞的凋亡率升高,改變了卵泡微環(huán)境,闡明了一種因子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞合成TGF-β1引起卵巢組織纖維化導(dǎo)致卵泡微環(huán)境改變的作用機(jī)制,為改善卵母細(xì)胞質(zhì)量治療提供了可能的作用靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R711.71

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8 李慧敏;陳麗霞;吳琪;戴珂珂;蘭莉;;卵巢纖維瘤及卵泡膜纖維瘤的超聲診斷[A];第二屆長(zhǎng)三角超聲醫(yī)學(xué)論壇暨2009年浙江省超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2009年

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1 徐連泉;腫瘤+腹水未必就是癌[N];農(nóng)村醫(yī)藥報(bào)（漢）;2009年

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1 周楓;卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫繼發(fā)卵巢纖維化的機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2017年

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