本文關(guān)鍵詞：趨化因子受體CCR4在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)、作用及其機(jī)制的研究　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：肺癌是全球和我國死亡率最高的惡性腫瘤,最新數(shù)據(jù)顯示,我國每年新發(fā)病65.3萬例,死亡率高達(dá)45.57/100,000。目前針對肺癌主要治療方案是以手術(shù)、放療、化療和分子靶向治療為基礎(chǔ)的綜合治療。雖然近年來惡性腫瘤的治療取得了很大的進(jìn)步,但由于肺癌發(fā)病率高、治療效果有限、去醫(yī)院看病時已是中晚期肺癌患者,而且5年生存率非常低,往往不到20%。隨著免疫學(xué)和腫瘤學(xué)的研究,宿主的免疫系統(tǒng)功能緊密相關(guān)與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展,即使我們?nèi)梭w擁有免疫監(jiān)視系統(tǒng),但是仍然不能阻止惡性腫瘤的發(fā)病,癌細(xì)胞可通過某些機(jī)制躲過機(jī)體的免疫監(jiān)視,在機(jī)體內(nèi)生長、轉(zhuǎn)移,給社會和家庭產(chǎn)生不良后果。趨化因子是一類小分子蛋白細(xì)胞因子家族成員中的一員,分子量大小為7-12k Da,具有能夠誘導(dǎo)相關(guān)白細(xì)胞定向趨化移動的功能。大量研究證實,趨化因子受體CCR4在各種腫瘤如ATLL、乳腺癌、胃癌、頭頸部癌中呈高表達(dá),在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中承擔(dān)著重要角色。目前關(guān)于CCR4與非小細(xì)胞肺癌關(guān)系的報道較少。主要研究方法:1.利用免疫組織化學(xué)法分析78例非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤組織和癌旁組織中CCR4的表達(dá)情況,綜合分析NSCLC患者臨床病例資料,探尋CCR4表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)臨床病理特征之間的關(guān)系,運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)和ELISA分析CCR4表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者全身免疫狀況和腫瘤組織免疫微環(huán)境的關(guān)系,初步探討CCR4作為NSCLC預(yù)后標(biāo)志和治療靶點的可能性。2.利用ELISA和Realtime-PCR法檢測腫瘤組織趨化因子CCL17和CCL22的表達(dá),Transwell細(xì)胞趨化實驗分析CCR4對腫瘤組織中Treg細(xì)胞的趨化作用,流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤組織培養(yǎng)上清誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的能力,并探究NSCLC患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對自身效應(yīng)性T細(xì)胞增殖的抑制作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制。3.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測NSCLC病人腫瘤組織和癌旁組織中NK細(xì)胞表面表達(dá)的活化型受體(NKG2D、NKp30、NKp46)和抑制型受體(NKG2A)的受體表達(dá)譜情況,分析腫瘤組織NK細(xì)胞與CCR4表達(dá)和TGF-?1濃度的相關(guān)性,觀察腫瘤組織培養(yǎng)上清是否影響NK細(xì)胞表型受體NKG2D的表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測CD69+NK細(xì)胞的表達(dá)以探究CD4+CD25+T細(xì)胞對NK細(xì)胞的活化調(diào)控及其機(jī)制,流式細(xì)胞術(shù)檢測CD107?+NK細(xì)胞的表達(dá)以探究CD4+CD25+T細(xì)胞對NK細(xì)胞細(xì)胞毒作用的調(diào)控及其機(jī)制。實驗結(jié)果與結(jié)論:1.在78例NSCLC肺癌組織標(biāo)本中,CCR4的陽性表達(dá)率為57.7%;在癌旁組織標(biāo)本中,陽性表達(dá)率為32.1%,統(tǒng)計分析顯示非小細(xì)胞肺癌組織中CCR4的表達(dá)明顯高于癌旁組織,差異有高度統(tǒng)計意義(P??0.01)。非小細(xì)胞肺癌組織中CCR4的陽性表達(dá)與NSCLC患者臨床分期相關(guān),而與患者的年齡、性別、組織學(xué)分型、病理分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)均無關(guān)。NSCLC患者外周血NK細(xì)胞數(shù)量較正常對照組沒有差異,CD8+細(xì)胞的數(shù)量和CD4+/CD8+比例較正常對照組存在差異,特別是Treg細(xì)胞和CCR4+Treg細(xì)胞的數(shù)量存在顯著升高,這些細(xì)胞亞群的數(shù)量缺陷反映了肺癌患者的全身免疫功能狀態(tài)。CCR4陽性NSCLC患者外周血細(xì)胞因子TGF-β1和IL-10濃度較正常對照組明顯增高,差異有高度統(tǒng)計意義(P0.01);而IL-2和IFN-γ濃度較正常對照組顯著降低,差異有高度統(tǒng)計意義(P0.01)。在CCR4陽性NSCLC患者腫瘤微環(huán)境中,NK細(xì)胞、Treg細(xì)胞、CCR4+Treg細(xì)胞的表達(dá)水平較癌旁組織存在顯著差異,這些細(xì)胞亞群的數(shù)量改變可能與肺癌患者腫瘤組織免疫微環(huán)境的免疫功能狀態(tài)有關(guān)。腫瘤組織中細(xì)胞因子TGF-β1和IL-10濃度較癌旁組織明顯增高,差異有高度統(tǒng)計意義(P0.01);而IL-2和IFN-γ濃度較癌旁組織顯著降低,差異有高度統(tǒng)計意義(P0.01)。腫瘤組織CCR4 m RNA較癌旁組織表達(dá)明顯增高,差異有顯著統(tǒng)計意義(P0.01);腫瘤組織TGF-β1 m RNA表達(dá)較癌旁組織明顯增高,差異有顯著統(tǒng)計意義(P0.01)。腫瘤組織中CCR4和TGF-β1的表達(dá)與Treg細(xì)胞水平呈明顯正相關(guān)。將78例NSCLC患者分成CCR4陽性組和CCR4陰性組,采用Kaplan-Meier法分析NSCLC患者三年生存期的比較,隨訪結(jié)果顯示CCR4陰性組患者較CCR4陽性組具有更長的生存期,差異有統(tǒng)計意義(P0.05),提示非小細(xì)胞肺癌患者CCR4陰性表達(dá)可預(yù)示患者生存期的改善。2.免疫磁珠分選后的CD4+CD25+T細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞純度均在90%以上,細(xì)胞獲得率較高。腫瘤組織中趨化因子CCL17和CCL22的濃度較癌旁組織均明顯增高,差異有高度統(tǒng)計意義(P0.01)。在rh CCL17和rh CCL22的作用下,Transwell板下室的CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量較空白對照組明顯增多,差異有高度統(tǒng)計意義(P0.01);CCR4中和抗體與rh CCL17/rh CCL22共同作用組,Transwell板下室的CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量較rh CCL17或rh CCL22單獨作用組明顯降低,差異有高度統(tǒng)計意義(P0.01),證明腫瘤組織中Treg細(xì)胞數(shù)量增多,可能與CCL17和CCL22的高濃度有關(guān),通過趨化因子受體CCR4募集Treg細(xì)胞進(jìn)入腫瘤組織。腫瘤組織Treg細(xì)胞數(shù)量的增多,還可能與腫瘤微環(huán)境中TGF-?1誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞有關(guān),中和性抗TGF-?1單克隆抗體能顯著降低其誘導(dǎo)作用。腫瘤組織組和癌旁組織組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+T細(xì)胞)均能抑制效應(yīng)性T細(xì)胞(CD4+CD25-T細(xì)胞)增值功能,而且腫瘤組織來源的Treg細(xì)胞抑制作用比癌旁組織組明顯增強(qiáng);隨著Tregs:Teffs的比例由0:1、0.25:1、0.5:1向1:1增高,效應(yīng)性T細(xì)胞(CD4+CD25-T細(xì)胞)的增殖指數(shù)逐漸降低,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對效應(yīng)性T細(xì)胞的抑制率也呈現(xiàn)逐漸增大,證明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對效應(yīng)性T細(xì)胞增值的抑制作用表現(xiàn)為濃度依耐性;當(dāng)Tregs對Teffs比例相同條件下,腫瘤組織組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對效應(yīng)性T細(xì)胞的抑制率強(qiáng)于癌旁組織組,差異有高度統(tǒng)計意義(P0.001)。中和性抗TGF-?1單克隆抗體組Tregs對Teffs增值的抑制率較未加入組明顯降低,差異有高度統(tǒng)計意義(P0.01),證明Treg細(xì)胞可能通過TGF-?途徑發(fā)揮其對Teff細(xì)胞增殖的抑制作用。3.腫瘤組織NK細(xì)胞較癌旁組織組低表達(dá)表面活化型受體NKG2D,差異有高度統(tǒng)計意義(P0.01),其他活化型受體NKp30、NKp46及抑制型受體NKG2A較癌旁組織組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),鑒于NKG2D是自然殺傷細(xì)胞的表面重要的活化性受體,在自然殺傷細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用時起關(guān)鍵因素,其表達(dá)下降可能會導(dǎo)致NK細(xì)胞沒有足夠量的活化型受體識別相應(yīng)的配體,進(jìn)一步導(dǎo)致NK細(xì)胞的活化程度不夠,影響NK細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的功能,進(jìn)而介導(dǎo)了腫瘤的免疫逃逸。腫瘤組織中CCR4 m RNA與NK細(xì)胞的百分比呈顯著負(fù)相關(guān)(P0.01),該結(jié)果提示腫瘤組織中CCR4 m RNA高表達(dá)可負(fù)向調(diào)控了NK細(xì)胞的數(shù)量。以肺癌組織TGF-?1濃度與NK細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行線性相關(guān)性分析,結(jié)果顯示腫瘤組織中TGF-?1濃度與NK細(xì)胞的百分比呈顯著負(fù)相關(guān)(P0.01),結(jié)果提示腫瘤組織中TGF-?1高濃度可能負(fù)向調(diào)控了NK細(xì)胞的數(shù)量。腫瘤組織培養(yǎng)上清混合培養(yǎng)基組NKG2D的表達(dá)較單純1640培養(yǎng)基組顯著下降,差異有顯著統(tǒng)計意義(P0.01);中和性抗TGF-?1單克隆抗體(20μg/ml)組NKG2D的表達(dá)較混合培養(yǎng)基組明顯上升,差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),證明腫瘤微環(huán)境可通過TGF-?通路誘導(dǎo)NK細(xì)胞活化型受體NKG2D的下調(diào),進(jìn)而抑制NK細(xì)胞的免疫學(xué)功能。rh IL-2單獨作用時腫瘤組織組NK細(xì)胞CD69+NK百分率較癌旁組織組降低,差異無統(tǒng)計意義(P0.05),但較未刺激組明顯升高,差異有高度統(tǒng)計意義(P0.01);CD4+CD25+T細(xì)胞混合培養(yǎng)后,CD69+NK細(xì)胞百分率較rh IL-2單獨作用組明顯降低,差異有高度統(tǒng)計意義(P0.01);使用中和性抗TGF-?1單克隆抗體可以減弱Treg對NK細(xì)胞活化的抑制作用,結(jié)果提示腫瘤組織中Treg細(xì)胞可能通過TGF-?通路調(diào)控NK細(xì)胞的活化。rh IL-2單獨作用時,腫瘤組織組NK細(xì)胞對K562細(xì)胞的細(xì)胞毒作用較癌旁組織組明顯降低,差異有高度統(tǒng)計意義(P0.01);腫瘤組織Treg細(xì)胞混合培養(yǎng)均能明顯降低兩組NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,差異有高度統(tǒng)計意義(P0.01);加入中和性抗TGF-?1單克隆抗體可部分逆轉(zhuǎn)Treg對NK細(xì)胞細(xì)胞毒作用的抑制作用,結(jié)果提示Treg細(xì)胞能通過TGF-?1信號通路抑制NK細(xì)胞細(xì)胞毒作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

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本文編號：1355216