本文關鍵詞：血漿miRNA與腰椎間盤退變的相關性及補腎壯督方的干預研究　出處：《廣州中醫(yī)藥大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的:1.篩選腰椎間盤退變(Lumbar intervertebral disc degeneration,LIDD)患者血漿中差異性表達的miRNA,探討差異性血漿miRNA是否在LIDD人群中具有特異性表達,是否對LIDD診斷有價值。2.建立大鼠LIDD的動物模型,進一步驗證差異性miRNA的表達與LIDD的關系,并檢測椎間盤中差異性miRNA靶基因介導的信號轉導通路的表達變化。3.通過補腎壯督方干預LIDD大鼠,探討補腎壯督方對差異性miRNA及其靶基因介導的信號轉導通路的表達影響,進一步揭示補腎壯督方延緩LIDD的作用機制。方法:1.臨床研究①選取2015年12月一 2016年4月就診于廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院脊柱科住院部及門診的3例LIDD患者作為病例組,同期選取3例年齡和性別相匹配且無LIDD的志愿者作為對照組。抽取LIDD患者和無LIDD志愿者的血漿,進行MicroRNA芯片的篩選。②通過實時熒光定量RT-PCR對MicroRNA芯片篩選出差異表達明顯的miRNA進行原位驗證,選出與LIDD密切相關的差異表達miRNA。③收集2015年12月一 2016年8月就診于廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院脊柱科住院部及門診的30例LIDD患者作為病例組,同期選取20例年齡和性別相匹配且無LIDD的志愿者作為對照組。根據原位驗證的結果,以及文獻報道研究,將與LIDD密切相關的miRNA在這50例人群中進行擴大樣本驗證研究,進一步驗證差異miRNA表達與LIDD的特異性。并對有差異性的miRNA進行受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析,使用ROC曲線下面積(AUC)評估它們的診斷價值。2.實驗研究選取60只雄性SD大鼠(3月齡),隨機分為假手術組、模型組、低劑量中藥組、中劑量中藥組和高劑量中藥組,每組各12只。假手術組:從大鼠的腹部右側旁正中切開,暴露L4到L6椎間盤后即縫合皮膚。其他組:從大鼠的腹部右側旁正中切開后,暴露L4到L6椎間盤,并采用纖維環(huán)的全層穿刺法建立大鼠LIDD模型。造模第2天,低劑量中藥組、中劑量中藥組和高劑量中藥組分別給予低劑量、中劑量和高劑量的補腎壯督方水煎液灌胃,假手術組和模型組則分別予等容積的生理鹽水灌胃。8周后,取大鼠的血漿和L4到L6的椎間盤。用HE染色觀察各組椎間盤的退變情況,并根據其退變程度進行病理評分,通過實時熒光定量RT-PCR檢測血漿和腰椎間盤中的特異性miRNA的表達,采用蛋白質印跡法和實時熒光定量RT-PCR分析腰椎間盤中特異性miRNA靶基因及其介導的信號轉導通路表達變化。結果:1.臨床研究①miRNA芯片篩選出LIDD人群中存在23個差異表達的miRNA,其中7個miRNA表達下調,16個miRNA表達上調。②根據MicroRNA芯片結果,對17個差異表達穩(wěn)定的miRNA進行了原位驗證,只有miRNA-4763-3p和miRNA-4767的下調表達差異顯著,具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。③結合文獻報道研究,將miRNA-4763-3p、miRNA-4767和miRNA-125a-5p進行了擴大樣本驗證研究。miRNA-4767和miRNA-125a-5p的表達顯著下調,具有統(tǒng)計學意義(P0.05),miRNA-4763-3p的表達下調則不明顯,無統(tǒng)計學差異(P0.05)。④ROC曲線分析顯示,miRNA-4767和miRNA-125a-5p是對LIDD診斷有價值的生物標記物(P0.05)。其中 miRNA-4767 AUC值為 0.735,95%置信區(qū)間 CI 為:0.591-0.850;miRNA-125a-5p 的 AUC 值為 0.863,95%置信區(qū)間 CI 為:0.759-0.967。2.實驗研究①各組腰椎間盤HE染色的形態(tài)學改變與假手術組比較,模型組的腰椎間盤發(fā)生了明顯的退變,組織退變評分顯著升高,具有統(tǒng)計學意義(P0.05);與模型組相比,低劑量、中劑量、高劑量中藥組的腰椎間盤退變均出現(xiàn)了明顯改善,組織學退變的評分均顯著降低,具有統(tǒng)計學意義(P0.05);補腎壯督方三個中藥組之間的組織學退變評分比較亦有統(tǒng)計學差異(P0.05)。②各組血漿中miRNA-125a-5p的表達變化與假手術組比較,模型組血漿中miRNA-125a-5p的表達降低,具有統(tǒng)計學差異(P0.05);與模型組相比,低、中、高劑量中藥組血漿中miRNA-125a-5p的表達明顯升高,有統(tǒng)計學差異(P0.05);補腎壯督方的三個中藥組血漿中miRNA-125a-5p之間的表達比較亦有統(tǒng)計學差異(P0.05)。③各組腰椎間盤組織中miRNA-125a-5p的表達變化與假手術組比較,模型組椎間盤組織中的miRNA-125a-5p表達明顯降低,具有統(tǒng)計學差異(P0.05);與模型組相比,低、中、高劑量中藥組椎間盤組織中的miRNA-125a-5p表達則明顯升高,有統(tǒng)計學差異(P0.05);補腎壯督方的三個中藥組椎間盤組織中的miRNA-125a-5p表達之間比較亦有統(tǒng)計學差異(P0.05)。④各組miRNA-125a-5p靶基因TP53INP1及p21、Caspase-3的基因表達變化與假手術組比較,模型組的TP53INP1、p21和caspase-3基因表達都明顯升高,具有統(tǒng)計學差異(P0.05);與模型組相比,低、中、高劑量中藥組的TP53INP1、p21和caspase-3基因表達都明顯降低,有統(tǒng)計學差異(P0.05);補腎壯督方的三個中藥組之間比較亦有統(tǒng)計學差異(P0.05)。⑤各組miRNA-125a-5p靶基因TP53INP1及p21、活化的Caspase-3的蛋白表達變化與假手術組比較,模型組的TP53INP1、p21和活化的Caspase-3(Active Caspase-3)蛋白表達都明顯升高,具有統(tǒng)計學差異(P0.05);與模型組相比,低、中、高劑量中藥組的TP53INP1、p21和caspase-3的基因表達都明顯減低,有統(tǒng)計學差異(P0.05);補腎壯督方的三個中藥組之間比較亦有統(tǒng)計學差異(P0.05)。結論:1.腰椎間盤退變患者外周循環(huán)血漿中存在差異表達的miRNA,血漿miRNA-4767和miRNA-125a-5p在LIDD患者中的表達顯著降低。2.血漿miRNA-4767和miRNA-125a-5p對LIDD的診斷具有較好的診斷效能,有望成為腰椎間盤退變精準診斷的新型生物標志物。3.補腎壯督方能夠有效的延緩大鼠腰椎間盤退變的病理改變,降低椎間盤退變的病理評分,并且療效具有一定的劑量依賴性。4.miRNA-125a-5p在腰椎間盤退變的大鼠血漿及退變的椎間盤組織中表達明顯降低,而在其靶基因TP53INP1及p21、Caspase-3的表達則明顯升高。這表明在LIDD的過程中miRNA-125a-5p及其靶基因TP53INP1介導的通路被激活,miRNA-125a-5p是腰椎間盤退變的一個潛在治療靶點。5.補腎壯督方能夠上調大鼠退變的椎間盤組織及血漿中miRNA-125a-5p的表達,并且下調其 TP53INP1、p21、Caspase-3 的基因及 TP53INP1、p21、活化的 Caspase-3的蛋白表達。其延緩椎間盤退變的作用機理與調控miRNA-125a-5p及其靶基因TP53INP1介導的通路活性變化有關,并且作用效果具有一定的劑量依賴性。
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【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R274.9

【參考文獻】

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