本文關鍵詞：多酸基熒光生物探針的制備及其在單增李斯特菌免疫檢測中的應用　出處：《吉林大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：近年來,全球食品安全惡性事件頻發(fā),食品安全已經(jīng)成為世界各國共同關注的公共衛(wèi)生問題之一,它不僅威脅到消費者的身體健康和生命安全,也嚴重影響了經(jīng)濟的發(fā)展。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道,由病原微生物引起的食源性疾病是影響食品安全最主要的因素之一。因此建立和完善食源性疾病及其致病菌的監(jiān)測體系,預防和控制食源性疾病傳播已引起世界各國衛(wèi)生部門和食品安全部門的高度重視。單核細胞增生性李斯特菌(Listeria Monocytogenes,LM)是一種重要的食源性人獸共患傳染性病原菌,它廣泛存在于肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜及冷藏食品中等,由其引起的感染疾病可導致人和動物的腦炎、腦膜炎、敗血癥以及孕婦的流產(chǎn)早產(chǎn)、流產(chǎn)、及死胎,且病死率較高,給畜牧業(yè)以及人類生命健康安全造成了嚴重威脅,已被WHO列為食源性病原菌主要監(jiān)測菌之一。因此,建立快速、準確的食品中LM病原菌的檢測技術,對于食品安全的防控、保障居民的健康、促進社會穩(wěn)定等具有重要意義。本課題研究主要是在前期研究工作的基礎上,設計合成了一種新型的功能化多酸基熒光微球,將其與LM單克隆抗體進行偶聯(lián)制備熒光生物探針,利用“雙抗體夾心”免疫原理,借助流式細胞檢測技術平臺,建立一種快速、準確、靈敏且特異的LM檢測方法。課題研究主要分為三個部分:第一部分LM多克隆抗體與單克隆抗體的制備及鑒定(1)多克隆抗體的制備及鑒定以LM全菌作為抗原,制備弗式完全佐劑和弗式不完全佐劑疫苗,采用皮下多點注射法免疫新西蘭白兔,收集抗血清,用辛酸-飽和硫酸銨法對血清中的抗體進行粗提,Protein G親和層析法進一步純化,BCA蛋白定量試劑盒測定抗體蛋白含量,優(yōu)化的間接ELISA方法檢測抗體的效價和特異性,SDS-PAGE凝膠電泳檢測抗體的純度,選用生物素標記試劑盒對上述純化的兔LM多克隆抗體Ig G進行生物素標記。結果顯示,經(jīng)Hi Trap Protein G HP純化后的LM多克隆抗體Ig G純度較高,可明顯觀察到兩條目的條帶,蛋白含量為10.65 mg·L-1,效價可達到1:25600,特異性較好,且每摩爾Ig G抗體標記的生物素摩爾數(shù)為3.63。(2)單克隆抗體的制備及鑒定應用雜交瘤細胞技術,以LM全菌作為抗原免疫BALB/c小鼠。免疫后分離免疫小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合。用優(yōu)化的間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細胞,采用有限稀釋法篩選亞克隆,篩選出能穩(wěn)定分泌LM抗體的陽性雜交瘤細胞,經(jīng)擴大培養(yǎng)后,制備小鼠單抗腹水。采用間接ELISA測定腹水中的單抗效價和特異性,單抗亞型鑒定試劑盒鑒定得到的抗體亞型,硫酸銨沉淀法結合Hi Trap IgM HP親和層析法進行純化,SDS-PAGE凝膠電泳試驗測定純度,BCA蛋白定量試劑盒測定抗體蛋白含量。結果顯示,經(jīng)過亞克隆篩選出1株能穩(wěn)定分泌LM單克隆抗體的雜交瘤細胞株5-B3,腹水中抗體效價大于1:12800,抗體亞型為Ig M型,純化后所獲得的抗體純度較高,濃縮后的抗體蛋白含量為1.75 mg·L-1,且特異性較好。第二部分功能化多酸基熒光微球及其LM生物探針的制備(1)功能化多酸基熒光生物微球的制備及表征采用層接層靜電自組裝技術,選用聚電解質PEI和PAA對表面含有羧基帶負電荷的聚苯乙烯微球進行表面改性,然后將所制備的帶負電荷的多酸熒光染料[N(C_4H_9)_4]_2[V_6O_(13){(OCH_2)_3CNH-CH_2-C_(16)H_9}_2](簡稱POMs-FD)包覆在微球表面,然后通過聚電解質PEI和PAA進一步修飾,最終使微球表面帶有羧基官能團。利用Zeta電位分析儀、熒光光譜儀、激光共聚焦顯微鏡和流式細胞儀對所制備的熒光微球進行表征,結果顯示多酸熒光染料POMs-FD可成功包覆到聚苯乙烯微球上,所制備的功能化多酸基熒光微球(POMs-FD@PS)具有良好的熒光發(fā)光特性,且穩(wěn)定性較好。(2)多酸基熒光生物探針的制備及表征利用EDC/NHS活化所制備的表面含有-COOH的POMs-FD@PS熒光微球,并與所制備的LM單克隆抗體進行偶聯(lián),優(yōu)化LM單克隆抗體標記量,制備可識別LM的多酸基熒光生物探針,通過流式細胞儀檢測技術平臺,將制備的多酸基熒光生物探針初步用于LM菌抗原的檢測。結果顯示,微球最佳蛋白偶聯(lián)量為105個微球:56μg蛋白,成功制備了識別LM的多酸基熒光生物探針,經(jīng)驗證該探針可用于LM流式微球-液相芯片檢測。第三部分LM流式微球-液相芯片檢測方法的建立與評價(1)LM流式微球-液相芯片檢測方法的建立將所制備的多酸基熒光生物探針,依據(jù)“雙抗體夾心”熒光免疫分析原理,利用流式細胞檢測技術平臺,通過優(yōu)化反應條件,建立一種LM流式微球-液相芯片檢測方法。結果顯示,本課題所建立的LM流式微球-液相芯片檢測方法的最佳反應條件為:單抗最佳偶聯(lián)濃度為28μg·mL~(-1),生物素標記的多克隆抗體工作濃度為250μg·mL~(-1),SA-PE的工作濃度為15μg·mL~(-1)。(2)LM流式微球-液相芯片檢測方法的評價對所建立的LM流式微球-液相芯片檢測方法的檢出限、特異性和重復性進行評價,同時與利用商品化的熒光微球所建立LM Luminex-液相芯片檢測方法和分離培養(yǎng)鑒定法進行比較,評價該方法的檢測效果。結果顯示,LM流式微球-液相芯片檢測法的最低檢出限為1.0×106 CFU·mL~(-1),且特異性和重復性較好。所建立LM Luminex-液相芯片檢測方法最佳反應條件為:單抗最佳偶聯(lián)濃度為15μg·mL~(-1),生物素標記的多克隆抗體工作濃度為250μg·mL~(-1),SA-PE的工作濃度為8μg·mL~(-1);將LM Luminex-液相芯片檢測方法與流式微球-液相芯片法進行比較,流式微球-液相芯片法的檢出限更低,穩(wěn)定性更好。將LM流式微球-液相芯片檢測法與分離培養(yǎng)鑒定法進行比較,48份實驗室模擬樣本,經(jīng)過24 h增菌培養(yǎng)后,利用已建立的流式微球-液相芯片法和傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法分別檢測,兩種方法的最低檢測限均可達到6 CFU·g-1,結果符合率為100%,表明所建立的流式微球-液相芯片方法具有較好的準確性,但LM流式微球-液相芯片方法可節(jié)省時間,且檢測工作無需帶菌操作,安全性更高。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R155.3

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