本文關鍵詞：酪氨酸去磷酸化增強表皮生長因子受體在乳腺癌治療中靶向性的研究　出處：《山東大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 蛋白酪氨酸磷酸酶H1 表皮生長因子受體 雌激素受體 去磷酸化 蛋白質間相互作用

【摘要】：研究背景與目的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一類名為表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)家族的細胞外蛋白配體的細胞表面受體。表皮生長因子受體是ErbB受體家族的成員之一,ErbB家族是包含四種緊密聯(lián)系蛋白的亞家族,這四種蛋白分別是受體酪氨酸激酶類：EGFR (ErbB-1)、 Her2/c-neu (ErbB-2)、Her 3 (ErbB-3)以及Her 4 (ErbB-4)。影響EGFR表達水平異常或活性的突變很有可能導致多種癌癥。EGFR是一種跨膜蛋白,它的結構包括細胞膜外的配體結合區(qū)域、跨膜區(qū)域以及胞內區(qū)域。其可激活的磷酸化位點位于胞內部分,包括Y992、Y1068以及Y1173等。雌激素受體(estrogen receptor, ER)是主要由雌激素(17β雌二醇)激活的一種類雌激素受體。一旦被雌激素激活,ER能夠被活化隨之易位到細胞核中并與DNA結合以調節(jié)不同基因的活性一一它是一種主要功能位于核內的DNA結合轉錄因子。雌激素受體ER在半數(shù)以上的乳腺癌中表達,其蛋白水平的高表達是乳腺癌的致癌因素之一,同時ER也是比較傳統(tǒng)而且重要的乳腺癌內分泌治療指標,醫(yī)學科學界針對ER的研究一直是乳腺癌治療研究的熱點之一,而且臨床治療方面已經(jīng)擁有了針對ER的比較成熟的治療藥物如他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)。在之前的研究中,本實驗室已經(jīng)發(fā)表一篇文章闡述了PTPH1對ER的調節(jié)作用。蛋白酪氨酸磷酸酶H1 (protein tyrosine phosphatase H1, PTPH1),從基因層面也被叫做酪氨酸蛋白磷酸酶非受體類型3 (tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 3, PTPN3),是由PTPN3基因編碼并且表達的酶。PTPH1是蛋白質酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases, PTPs)家族的一個成員,主要在細胞質中發(fā)揮功能。多種研究顯示PTPs家族成員大多可調節(jié)多種細胞自身活動,包括細胞生長、分化、有絲分裂周期以及致癌性轉化等。研究證實PTPH1在乳腺癌中有50%的表達率,對乳腺癌的臨床診療工作有著重要的科研價值。酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKI),是一類可以針對性地抑制酪氨酸激酶發(fā)揮正常作用的化合物。其主要生理作用是阻斷ATP中的磷酸根結合酪氨酸殘基,從而達到控制癌細胞增殖的作用�，F(xiàn)今比較有效的TKI類藥物如：拉帕替尼(Lapatinib, LAP)以及吉非替尼(Gefitinib, GEF),前者的主要治療靶點是EGFR蛋白以及Her2蛋白,國際上主要用于乳腺癌晚期、乳腺轉移癌以及聯(lián)合治療；后者的主要治療靶位是EGFR。本課題組在早先研究中觀察到：PTPH1會對雌激素受體ER的Y537位點去磷酸化,同時增加ER的核內轉移活動,從而提升乳腺癌細胞對雌激素受體拮抗劑他莫昔芬的敏感性；此外,本實驗室己發(fā)表文章中闡述了PTPH1可以對表皮生長因子受體EGFR的Y1173位點進行去磷酸化的可能。綜合上述發(fā)現(xiàn),我們考慮PTPH1蛋白水平變化意義重大：PTPH1對EGFR在Y1173位點的去磷酸化很可能具有潛在的調節(jié)TKI類抗腫瘤藥物一一如拉帕替尼和吉非替尼敏感性的可能；而針對PTPH1可以同時調節(jié)EGFR與ER兩種蛋白分子,我們設計實驗探討PTPH1對TKI類藥物與ER拮抗劑聯(lián)合用藥效果的影響,并針對上述一系列設想建立了課題思路。研究方法為了檢驗上述假設,我們預先設計了三部分比較系統(tǒng)性的實驗。在第一部分實驗中,選用PTP H1過表達癌細胞、正常表達PTPH1的同細胞系癌細胞以及PTPH1敲低癌細胞株進行相關TKI抗癌藥物(拉帕替尼Lapatinib,吉非替尼Gefitinib)敏感性實驗,以檢測PTPH1表達水平對所選擇藥物抗癌效果的影響。在第二部分實驗中,對相關細胞系進行有條件的培養(yǎng),隨后用Western blot實驗檢測PTPH1是否可以調節(jié)相關抗癌藥物的靶向蛋白EGFR蛋白水平、穩(wěn)定性以及相關位點的磷酸化水平。最后第三部分研究計劃,包涵了一系列綜合實驗,包括Western blot、免疫沉淀、核漿分離實驗等對PTPH1調節(jié)EGFR的膜易位、ER的核內易位以及ER與EGFR的相互作用進行了研究分析,同時這部分實驗可以綜合性地探討PTPH1是否能夠分別調節(jié)EGFR蛋白水平和促進ER轉移到細胞核內,從而增強相關靶向治療藥物(TKI類藥物和他莫昔芬Tamoxifen)對乳腺癌細胞的聯(lián)合抑制作用。上述實驗構成了一整個體系,探討PTPH1對TKI類藥物(以及與他莫昔芬聯(lián)合用藥)的敏感性調節(jié)及其原理。結果1.PTPH1提升了乳腺癌細胞對TKI類藥物的敏感性：PTPH1表達水平的提高特異性增強了MCF7、T47D以及MDA-MB-231 (231)細胞對TKI類藥物(拉帕替尼和吉非替尼)的敏感性；而在同類細胞系當中,如果PTPH1蛋白被敲低會下調TKI類藥物的效果——PTPH1水平降低之后細胞耐藥性出現(xiàn)。PTPH1水平?jīng)Q定了癌細胞對TKI類藥物的抵抗。2. PTPH1可以對EGF R在Y1173位點上進行去磷酸化。與PTPH1正常表達的對照組相比,PTPH1過表達細胞中Y1173位點的磷酸化水平明顯降低,而且這種去磷酸化作用也存在于體外293T細胞中；反之PTPH1敲低的細胞系的Y1173磷酸化水平獲得上調。PTP HI對Y1173位點的去磷酸化依賴其自身催化能力,失去催化能力的PTPH1突變體PTPH1/S459A和PTPH1/DA沒有去磷酸化功能。3. PTPH1可以上調EGFR蛋白表達水平：Western Blot證實在PTPH1過表達細胞中,EGFR的水平明顯高于PTPH1正常表達細胞；反之,癌細胞中的PTPH1敲低之后,EGFR水平隨之下降。PTPH1失去磷酸化功能的突變體PTPH1/S459A無法上調EGFR蛋白。在體外293T細胞中,PTPH1上調EGFR蛋白的功能仍然存在。放線菌酮(Cycloheximide, CHX)實驗證實PTPH1上調EGFR蛋白的原因主要為增強EGF R蛋白的穩(wěn)定性；EGFR的突變體EGFR/Y1173F存在不依賴PTPH1的高穩(wěn)定性；PTPH1的突變體PTPH1/S459A無法提高EGFR蛋白的穩(wěn)定性。泛素實驗證實PTPH1過表達導致泛素介導的EGFR蛋白降解減少；EGFR/Y1173F存在PTPH1非依賴性泛素化降解減少。相關細胞集落實驗發(fā)現(xiàn)EGFR過表達明顯提高TKI的藥物作用；PTP H1過表達提升TKI藥物對腫瘤細胞的抑制作用;EGFR/Y1173F過表達導致了乳腺癌細胞對TKI藥物的耐藥性,而且這種耐藥性無法被PTPH1調節(jié)。最重要的是,免疫組化實驗證實在臨床標本中,PTPH1與EGFR蛋白水平呈明顯的正相關。4. PTP H1可以降低EGF R與ER的相互作用。核漿分離實驗證實,PTPH1不僅可以促進核內ER水平提高,而且促進了EGFR在細胞膜上的富集。免疫沉淀實驗發(fā)現(xiàn)：PTPH1過表達可以降低EGFR與ER的結合,使EGFR-ER復合物水平降低；PTPH1/S459 A無法降低EGFR與ER的相互作用。結合相關細胞集落實驗我們推測,EGFR與ER的相互作用可影響TKI藥物的作用。5.ER的核內蛋白水平升高導致EGFR與ER的相互作用減弱。免疫沉淀實驗發(fā)現(xiàn)：細胞質中的ER可以與EGFR相結合,產(chǎn)生EGFR-ER復合物；ER的突變體ER/T311A核內蛋白降低,與EGFR產(chǎn)生的復合物增加。相關細胞集落實驗顯示：ER/T311A過表達組與野生型ER過表達組相比,耐藥性增強。我們推測EGFR-ER復合物導致了細胞對TKI產(chǎn)生耐藥性。6. PTPH1提高乳腺癌細胞對TKI與他莫昔芬(TAM)聯(lián)合用藥的敏感性。細胞集落實驗顯示：PTPH1過表達可以分別提高TKI類藥物或者他莫昔芬的作用；PTPH1過表達對于TKI與他莫昔芬聯(lián)合用藥效果的提升作用更為顯著；PTPH1的突變體——沒有去磷酸化作用的PTPH1/S459A無法提高乳腺癌細胞對TKI與他莫昔芬聯(lián)合用藥的敏感性。結論1. PTPH1增加乳腺癌細胞對TKI類藥物的敏感性。2. PTP H1在體外細胞和乳腺癌細胞中均可對EGFR在Y1173位點進行去磷酸化。3. PTPH1通過對EGFR的Y1173位點的去磷酸化增加EGFR的穩(wěn)定性。4.PTPH1通過催化活性降低EGFR-ER復合體的水平,從而提高TKI類藥物與ER拮抗劑聯(lián)合用藥對乳腺癌細胞的抑制作用。意義本課題的實驗結果表明,EGFR蛋白水平對于TKI類藥物乳腺癌治療的敏感性起到了關鍵性指示作用；經(jīng)PTPHI調節(jié),EGFR的關鍵殘基Y1173在進行去磷酸化之后增加了EGFR穩(wěn)定性,同時影響了TKI類藥物的效果。首先,我們證實PTPH1可在Y1173位點對EGFR進行去磷酸化；其次,我們還發(fā)現(xiàn)PTPH1可以增強EGFR蛋白的穩(wěn)定性和細胞膜EGFR蛋白水平。這些結果表明,PTPH1可能參與了EGFR磷酸化水平調節(jié)環(huán)路；最重要的是,PTPH1利用其磷酸催化活性增加了EGFR細胞膜定位,而且對Y1173位點去磷酸化以提升表皮生長因子受體EGFR蛋白的穩(wěn)定性。此外,PTPH1不僅有己發(fā)現(xiàn)的對ER進行去磷酸化并增加其核移位的作用,還可以對EGFR的Y1173位點去磷酸化,促使EGFR向細胞膜富集,上述功能降低了EGFR-ER復合體生成,促進了EGFR靶向治療藥物的抗癌作用。綜上,由PTPH1誘導的EGFR/Y1173去磷酸化上調乳腺癌EGFR膜受體可能是一種提高其靶向治療藥物臨床效果的方法；結合PTPH1的ER核異位調節(jié)功能,PTPH1調節(jié)EGFR和ER相互作用的功能在乳腺癌聯(lián)合用藥治療中有著重要的可研究價值,對于將來設計研究進一步克服藥物治療耐藥性的課題提供了方向。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 黃嘯原;用“印度閱兵”形容乳腺癌合適嗎?[J];診斷病理學雜志;2001年02期

2 張嘉慶,王殊,喬新民;乳腺癌的現(xiàn)狀和遠景[J];中華外科雜志;2002年03期

3 張維彬,汪波,石靈春;中醫(yī)藥在現(xiàn)代乳腺癌治療中的運用[J];中國中西醫(yī)結合急救雜志;2002年01期

4 薛志勇;食物與乳腺癌[J];山東食品科技;2002年04期

5 王旬果,王建軍,鄭國華;乳腺癌相關標志物的研究進展[J];山東醫(yī)藥;2002年33期

6 陸尚聞;;男人也患乳腺癌[J];環(huán)境;2003年12期

7 ;新技術清晰拍攝早期乳腺癌細胞[J];上海生物醫(yī)學工程;2005年04期

8 田富國;郭向陽;張華一;;乳腺癌診治研究新進展[J];腫瘤研究與臨床;2005年S1期

9 馬濤,谷俊朝;血管內皮生長因子與乳腺癌的臨床研究進展[J];國外醫(yī)學(外科學分冊);2005年01期

10 郭慶良,谷俊朝;乳腺癌和瘦素相關性研究進展[J];國外醫(yī)學.外科學分冊;2005年03期

相關會議論文 前10條

1 于永利;;抗乳腺癌免疫治療融合蛋白[A];中國免疫學會第四屆學術大會會議議程及論文摘要集[C];2002年

2 郭紅飛;;中醫(yī)治療乳腺癌的策略[A];江西省中醫(yī)、中西醫(yī)結合腫瘤學術交流會論文集[C];2012年

3 龐朋沙;伍會健;;乳腺癌治療靶標的研究進展[A];北方遺傳資源的保護與利用研討會論文匯編[C];2010年

4 陸勁松;邵志敏;吳炅;韓企夏;沈鎮(zhèn)宙;;新型維甲酸抑制乳腺癌細胞的生長及誘導凋亡的機制研究[A];2000全國腫瘤學術大會論文集[C];2000年

5 劉愛國;胡冰;;乳腺癌臨床治療進展[A];安徽省抗癌協(xié)會第四次代表大會暨乳腺癌、肺癌專業(yè)委員會成立會議、安徽省腫瘤防治進展學術研討會論文匯編[C];2001年

6 張嘉慶;王殊;喬新民;;乳腺癌的現(xiàn)狀和遠景[A];第一屆全國中西醫(yī)結合乳腺疾病學術會議論文匯編[C];2002年

7 劉清俊;;乳腺癌綜合治療的新進展[A];山西省抗癌協(xié)會第六屆腫瘤學術交流會論文匯編[C];2003年

8 邵志敏;;21世紀乳腺癌治療的展望[A];第三屆中國腫瘤學術大會教育論文集[C];2004年

9 陳松旺;張明;;乳腺癌治療的回顧與展望[A];西部地區(qū)腫瘤學學術會議論文匯編[C];2004年

10 白霞;傅建新;丁凱陽;王兆鉞;阮長耿;;組織因子途徑抑制物-2在乳腺癌細胞中的表達研究[A];第10屆全國實驗血液學會議論文摘要匯編[C];2005年

相關重要報紙文章 前10條

1 ;血檢有望揭示乳腺癌治療效果[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2004年

2 記者 鄭曉春;乳腺癌細胞擴散基因被找到[N];科技日報;2007年

3 中國軍事醫(yī)學科學院腫瘤中心主任 宋三泰;乳腺癌有了新療法[N];中國婦女報;2002年

4 王艷紅;抑制ＤＮＡ修補可消滅乳腺癌細胞[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2005年

5 詹建;乳腺癌飲食 兩個時期不一樣[N];中國中醫(yī)藥報;2006年

6 辛君;乳腺癌擴散基因“浮出水面”[N];大眾衛(wèi)生報;2009年

7 記者 毛黎;美發(fā)現(xiàn)有效抑制乳腺癌細胞生長的分子[N];科技日報;2010年

8 記者 吳春燕　通訊員 王麗霞;乳腺癌治療將有新途徑[N];光明日報;2011年

9 王樂　沈基飛;我科學家發(fā)現(xiàn)導致乳腺癌耐藥的新標志物[N];科技日報;2011年

10 劉霞;一種天然分子能阻止乳腺癌惡化[N];科技日報;2011年

相關博士學位論文 前10條

1 柴紅燕;疾病狀態(tài)下CYP4Z1和4A的生物學行為及其藥物干預研究[D];武漢大學;2012年

2 李凱;ID(inhibitor of DNA binding)家族蛋白調控乳腺細胞的分化并影響乳腺癌的預后[D];復旦大學;2014年

3 江一舟;乳腺癌新輔助化療前后基因變異檢測及其功能論證[D];復旦大學;2014年

4 馬邵;酪氨酸去磷酸化增強表皮生長因子受體在乳腺癌治療中靶向性的研究[D];山東大學;2015年

5 姚若斯;精氨酸甲基轉移酶PRMT7誘導乳腺癌細胞發(fā)生表皮—間質轉換及轉移的作用機制研究[D];東北師范大學;2015年

6 侯培鋒;α-酮戊二酸二甲酯(DM-2KG)上調缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)誘發(fā)高致瘤性干細胞樣乳腺癌細胞機制研究[D];福建醫(yī)科大學;2014年

7 李麗麗;分泌蛋白SHON調控乳腺癌細胞EMT的分子機制研究[D];東北師范大學;2015年

8 陳麗艷;PI3K抑制劑聯(lián)合組蛋白去乙酰化酶抑制劑對乳腺癌協(xié)同殺傷作用的分子機制研究[D];延邊大學;2015年

9 樸俊杰;乳腺癌差異基因篩選及PAIP1對其生物學行為的影響[D];延邊大學;2015年

10 余科達;功能性論證雌醌代謝酶基因多態(tài)性與乳腺癌發(fā)生易感性的關聯(lián)[D];復旦大學;2009年

相關碩士學位論文 前10條

1 杜文英;乳腺癌分子亞型的臨床與病理特點[D];鄭州大學;2011年

2 賈曉菲;彩色多普勒超聲與乳腺癌病理及免疫組化指標的相關性研究[D];內蒙古大學;2015年

3 靳文;乳腺癌全基因組DNA甲基化修飾的研究[D];內蒙古大學;2015年

4 吳坤琳;TLR4/MyD88信號通路對乳腺癌侵襲性影響的實驗研究[D];福建醫(yī)科大學;2015年

5 葛廣哲;樹，

本文編號：1326081