發(fā)布時間：2017-12-21 09:29

  本文關鍵詞：人胚胎干細胞來源視網(wǎng)膜前體細胞生物學特性的實驗研究　出處：《鄭州大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：背景:視網(wǎng)膜變性疾病(retinal degeneration,RD)是一類以視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細胞或/和視網(wǎng)膜光感受器細胞功能異常而引起視網(wǎng)膜光感受器細胞凋亡為病理改變的致盲性眼病。RD的治療包括細胞移植、基因治療、藥物治療和人工視網(wǎng)膜假體等。眼部細胞移植具有可操控性,效果易于評價,是國內(nèi)外研究的熱點。視網(wǎng)膜前體細胞(retinal precursor cell,RPC)、誘導多潛能干細胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)、胚胎干細胞(embryonic stem cell,ESC)等多種來源的種子細胞用于移植至RD動物模型視網(wǎng)膜下腔,以觀察細胞移植治療視網(wǎng)膜變性疾病的效果。組織特異性來源的RPC在體外可懸浮或貼壁培養(yǎng),有一定的增殖能力和分化能力,移植至RD動物模型的視網(wǎng)膜下腔后可在一定程度上延緩視網(wǎng)膜變性的發(fā)展和改善視網(wǎng)膜功能。然而,組織特異性來源RPC來源局限,限制了其作為臨床轉(zhuǎn)化細胞的應用。iPSC可經(jīng)患者自身成熟細胞誘導而來,具有較強的增殖能力和分化能力,在一定程度上減少了免疫排斥問題,將其來源的RPC移植至視網(wǎng)膜變性動物模型的視網(wǎng)膜下腔,可在一定程度上延緩視網(wǎng)膜變性的發(fā)展和改善視網(wǎng)膜功能。但是iPSC的轉(zhuǎn)化效率較低,增加了其作為移植細胞的成本和難度。目前,經(jīng)美國食品與藥品管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準,人胚胎干細胞(human embryonic stem cell,hESC)來源的RPE細胞可用于Stargardt病和干性年齡相關性黃斑變性(Age-related Macular Degeneration,AMD)的Ⅰ/Ⅱ期臨床實驗,研究結(jié)果顯示在平均22月的隨訪中,移植細胞可以改善或維持部分患者的視功能,沒有發(fā)現(xiàn)異常增殖。本研究選擇用hESC作為研究對象,擬利用人胚胎干細胞來源的視網(wǎng)膜前體細胞作為移植細胞觀察其對RD的治療作用。本研究共分為三部分:第一部分:檢測本實驗室hesc的干性特征和增殖能力。第二部分:由hesc定向向視網(wǎng)膜前體細胞誘導分化,并對誘導分化過程中各個階段用細胞免疫熒光(immunocytochemistry,icc),流式細胞術(flowcytometry,fcm)和細胞周期檢測等方法進行鑒定,了解hesc在體外分化的生物學特性,明確適合于眼部移植細胞的發(fā)育階段。人胚胎干細胞作為臨床轉(zhuǎn)化細胞的一個重大問題是其具有致瘤性。由于胚胎干細胞的無限增殖能力,其在宿主體內(nèi)可能會無限增殖而致瘤。階段特異性胚胎表面抗原(stage-specificembryonicantigens,ssea)是胚胎干細胞的特異性標記物,在人胚胎干細胞中表達為階段特異性胚胎表面抗原4(stage-specificembryonicantigen4,ssea4)。因此,為了降低hesc來源的細胞在宿主體內(nèi)的致瘤性,本實驗在進行細胞移植前,擬采用流式細胞分選術(fluorescence-activatedcellsorting,facs),用反向選擇的方法,將誘導分化過程中殘留的ssea4陽性的人胚胎干細胞排除,選擇ssea4陰性的hesc來源rpc作為移植細胞,檢測移植細胞的致瘤風險。第三部分:在第二部分的基礎上,借助流式細胞分選術,將hesc來源的視網(wǎng)膜前體細胞用反向選擇的方法排除ssea4陽性的細胞。將篩選的ssea4陰性的視網(wǎng)膜前體細胞移植至視網(wǎng)膜變性疾病動物模型皇家外科學院(royalcollegeofsurgeon,rcs)大鼠視網(wǎng)膜下腔,以評估hesc來源的rpc移植治療視網(wǎng)膜變性疾病的效果;同時,將hesc來源的rpc移植至嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠皮下,以評估其安全性,為hesc向臨床轉(zhuǎn)化治療rd提供理論依據(jù)。第一部分人胚胎干細胞的培養(yǎng)鑒定及擬胚體的形成目的:檢測人胚胎干細胞的干性標記和增殖能力;探索適合于本研究的擬胚體(embryonicbody,eb)形成方法。方法:體外培養(yǎng)人胚胎干細胞株h1,采用細胞免疫熒光染色、流式細胞檢測術、細胞周期檢測和細胞增殖曲線繪制等方法對人胚胎干細胞標記物ssea4及細胞株h1的增殖能力進行鑒定。比較懸浮培養(yǎng)法、懸滴培養(yǎng)法及aggrewelltm400培養(yǎng)板培養(yǎng)法形成的擬胚體的數(shù)量和大小。結(jié)果:1.體外培養(yǎng)的單個人胚胎干細胞特點:體積小,核大,核與細胞質(zhì)的比例高。細胞集落特點為界限清晰,中心區(qū)發(fā)亮。2.流式細胞術檢測結(jié)果表明,不同代數(shù)p42、p47和p52人胚胎干細胞ssea4陽性比例分別為97.88±2.21%,98.04±1.85%和98.00±2.02%,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。細胞免疫熒光染色數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示,p42、p47和p52人胚胎干細胞ssea4陽性比例分別為97.22±2.11%,96.37±3.55%和96.33±3.44%,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。3.流式細胞術及細胞免疫熒光染色檢測細胞增殖標記物ki67的陽性表達率,分別為98.50±3.01%和99.60±1.80%。細胞周期檢查結(jié)果顯示,66.24±3.27%細胞處于細胞周期的增殖期(g2/m和s期)。增殖曲線顯示hesc在傳代培養(yǎng)第5天達到增殖平臺期,細胞可增殖30倍以上。4.以種1ml細胞重懸液所形成eb數(shù)量來計算,懸滴培養(yǎng)法得到小直徑eb數(shù)量為0.33±0.58,中等大小eb數(shù)量為37.33±0.58,大直徑eb數(shù)量為0.67±0.58,中等大小eb數(shù)量與所形成的小直徑eb數(shù)量相比較具有明顯差異(p0.001),與大直徑eb數(shù)量相比較具有明顯差異(p0.001),小直徑eb數(shù)量與大直徑eb數(shù)量相比較差異沒有統(tǒng)計學意義((p0.05)。懸浮培養(yǎng)法得到的小直徑eb數(shù)量為323.33±25.17,中等大小eb數(shù)量為348.33±25.66,大直徑eb數(shù)量為373.68±15.14,中等大小eb數(shù)量與小直徑eb數(shù)量相比較差異沒有統(tǒng)計學意義(p0.05),與大直徑eb數(shù)量相比較差異沒有統(tǒng)計學意義(p0.05),小直徑eb數(shù)量與大直徑eb數(shù)量相比較沒有明顯差異(p0.05)。用aggrewelltm400培養(yǎng)板培養(yǎng)方法,我們得到的小直徑eb數(shù)量為74.33±5.86,中等大小eb數(shù)量為906.68±60.28,大直徑eb數(shù)量為66.33±5.51,中等大小eb數(shù)量與小直徑eb數(shù)量相比較具有明顯差異(p0.001),與大直徑eb數(shù)量相比較具有明顯差異(p0.001),小直徑eb數(shù)量與大直徑eb數(shù)量相比較差異沒有統(tǒng)計學意義((p0.05)。懸滴培養(yǎng)法及aggrewelltm400培養(yǎng)板培養(yǎng)法所形成eb直徑大小相對均一。三種方法均以種細胞1ml細胞重懸液所形成eb數(shù)量來計算。懸滴培養(yǎng)法形成總eb數(shù)量為38.33±0.58;懸浮培養(yǎng)法形成的總eb數(shù)量為1045.33±62.32,與懸滴培養(yǎng)法所形成eb數(shù)量相比較,具有明顯的統(tǒng)計學差異(p0.001);aggrewelltm400培養(yǎng)板培養(yǎng)法所形成的eb數(shù)量約為1047.33±51.39,與懸滴法培養(yǎng)所形成eb數(shù)量相比較,具有明顯的統(tǒng)計學差異(p0.001),與懸浮培養(yǎng)法所形成總的eb數(shù)量相比較,沒有明顯的統(tǒng)計學差異(p0.05)。懸浮培養(yǎng)法與aggrewelltm400培養(yǎng)板培養(yǎng)法所形成擬胚體數(shù)量較大,與懸滴培養(yǎng)法相比較具有顯著統(tǒng)計學意義(p0.001)。結(jié)論:1.人胚胎干細胞株h1具有傳代穩(wěn)定性,能夠維持人胚胎干細胞的增殖能力。2.懸滴培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)或aggrewelltm400培養(yǎng)板培養(yǎng)等方法均可形成eb,懸浮培養(yǎng)方法形成的eb具有數(shù)量大的優(yōu)點,但是eb大小不均一;懸滴培養(yǎng)方法形成的eb具有大小均一的優(yōu)點,但是數(shù)量相對有限;aggrewelltm400培養(yǎng)板的方法所形成的eb具有數(shù)量多,大小均一的優(yōu)點。因此,本實驗選擇aggrewelltm400培養(yǎng)板形成eb的方法。第二部分人胚胎干細胞向視網(wǎng)膜前體細胞的定向分化目的:探索hesc在體外高效定向誘導分化為視網(wǎng)膜前體細胞的方法。方法:首先我們用aggrewelltm400培養(yǎng)板培養(yǎng)法將hesc在體外形成eb,然后將eb懸浮培養(yǎng)3天后換用視網(wǎng)膜前體細胞培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng),在培養(yǎng)的第10天,在視網(wǎng)膜前體細胞培養(yǎng)基中添加t3和taurine。在誘導分化培養(yǎng)的第0天、10天、20天、30天及40天,對分化細胞的形態(tài)和細胞標記物等進行鑒定。結(jié)果:1.hesc的細胞周期時相為g0/g1期占40.81±4.44%,s期占36.25±3.91%,g2/m期占22.95±3.21%;誘導分化第10天,g0/g1期、s器和g2/m期細胞分別占67.49±2.75%、19.38±3.25%和13.12±5.08%;誘導分化第20天,g0/g1期、s器和g2/m期細胞分別占80.70±1.59%、9.43±0.73%和9.87±0.97%;誘導分化第30天,g0/g1期、s器和g2/m期細胞分別占81.53±2.76%、6.23±1.54%和12.24±4.31%;誘導分化第40天,g0/g1期、s器和g2/m期細胞分別占88.89±1.45%、5.74±1.20%和5.37±1.16%。同一細胞周期時相與hesc的數(shù)據(jù)相比較,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.001)。2.流式細胞術及細胞免疫熒光檢測顯示hesc中ki67的陽性表達率為98.70±0.92%,在分化培養(yǎng)的第10天、20天、30天及40天,ki67的陽性率分別為86.40±5.54%,44.23±3.29%,15.10±4.32%,7.87±1.69%。細胞免疫熒光檢測結(jié)果,分化第0天、10天、20天、30天和40天ki67的陽性表達率分別為97.70±0.92%,91.40±3.63%,42.90±2.52%,13.77±2.28%和7.20±2.39%。分化培養(yǎng)第10天與未分化狀態(tài)相比較,ki67表達量下降,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.01);分化培養(yǎng)第20天與分化培養(yǎng)第10天相比較,ki67表達量下降,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.001);分化培養(yǎng)第30天,與分化培養(yǎng)第20天相比較,ki67表達量下降,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.001);分化培養(yǎng)的第40天,與分化培養(yǎng)第30天的細胞相比較ki67的表達量下降(p0.05)3.hesc的標記物ssea4在細胞未分化時表達率為98.80±1.02%,在分化的第10天、20天、30天和40天,ssea4的陽性率分別為48.80±4.20%,7.64±1.13%,2.21±0.79%,0.93±0.44%,與前一個時間點相比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(p0.01)。4.流式細胞術檢測,在誘導分化第0天、10天、20天、30天和40天,pax6的表達量分別為0.63±0.16%,34.73±2.10%,45.63±2.94%,30.97±2.12%,12.23±2.79%;sox2的表達量分別為0.40±0.27%,49.07±4.51%,69.47±4.58%,17.20±2.82%,11.10±1.99%;rax的表達量分別為0.31±0.18%,66.70±6.98%,46.77±6.69%,11.33±2.53%,9.70±1.87%;nestin的表達量分別為0.61±0.26%,82.10±6.86%,69.20±5.47%,23.00±6.06%,6.90±2.46%。免疫熒光半定量分析,在分化的第0天、10天、20天、30天和40天,pax6的表達量分別為0%,35.73±5.10%,44.69±4.38%,28.96±3.51%,11.69±3.58%;sox2的表達量分別為0%,50.88±3.42%,67.68±3.52%,18.34±3.12%,12.29±2.03%;rax的表達量分別為0%,65.68±7.15%,48.03±6.58%,10.24±2.47%,10.05±2.03%;nestin的表達量分別為0%,80.12±7.03%,67.20±5.64%,22.35±5.87%,7.09±2.74%。與前一個時間點相比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。5.在誘導分化0天、10天、20天、30天和40天,流式細胞術檢測otx2表達量分別為0.49±0.16%,9.93±2.01%,65.40±5.57%,39.20±3.70%,21.10±3.89%;免疫熒光染色otx2表達量分別為0.49±0.16%,3.27±1.46%,61.07±3.45%,39.33±3.67%和21.67±4.33%。光感受器前體細胞標記物crx在分化第20天時檢測到有表達,流式細胞術檢測結(jié)果為8.17±1.48%,隨后表達量逐漸增多,在分化第30天及40天時表達量分別為35.07±2.40%和49.30±5.10%。流式細胞術檢測結(jié)果顯示視網(wǎng)膜光感受器細胞標記物recoverin在分化的第0天、10天、20天、30天和40天的陽性表達率分別為0.24±0.18%,0.72±0.55%,6.77±0.95%,16.49±1.99%和24.14±3.04%。結(jié)論:1.hesc在誘導分化的過程中,細胞增殖能力逐漸下降。2.懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法,通過添加誘導因子,可以將hesc誘導為視網(wǎng)膜前體細胞和視網(wǎng)膜光感受器前體細胞。3.誘導分化第20天的細胞主要為視網(wǎng)膜前體細胞,我們選擇誘導分化第20天的細胞進行下一步的實驗。第三部分人胚胎干細胞來源視網(wǎng)膜前體細胞治療視網(wǎng)膜變性疾病的有效性及安全性研究目的:探討hesc來源的視網(wǎng)膜前體細胞移植至rcs大鼠視網(wǎng)膜下腔后的存活、遷移能力,及對視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能的影響,并進行安全性檢測。方法:根據(jù)本實驗第二部分的結(jié)果,我們選擇體外分化培養(yǎng)第20天的細胞,用流式細胞分選術篩選ssea4陰性細胞,并用cm-dil標記,將其移植入出生后3周的rcs大鼠視網(wǎng)膜下腔,對移植后第4周、8周和12周視網(wǎng)膜下腔及外核層存活的細胞數(shù)量進行計數(shù);對細胞治療組、偽手術組和野生型大鼠組在細胞移植后第4周、8周和12周的視網(wǎng)膜進行免疫組織化學染色(immunohistochemistry,ihc),并測量視網(wǎng)膜外核層(outernuclearlayer,onl)厚度。同時對細胞移植組和偽手術組在移植手術進行前1天,移植手術進行后第4周、8周和12周的視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram,erg)進行檢測。將12只嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(severecombinedimmunedeficiency,scid)隨機分為實驗組和陽性對照組兩組,分別在腹股溝皮下注射hesc來源rpc和hesc,觀察是否有成瘤或其他病變。結(jié)果:1.移植術后第4周、8周和12周,移植細胞多位于穿刺點附件的視網(wǎng)膜下腔。移植術后第4周,視網(wǎng)膜輕度脫離;移植術后第8周,視網(wǎng)膜較移植后第4周時平伏,移植后第12周,視網(wǎng)膜較移植術后第8周時平伏。移植細胞在視網(wǎng)膜下腔可存活,并向外核層遷移。移植后第4周、8周及12周單個視野移植細胞的存活數(shù)量分別為7.77±0.97,5.87±0.42,4.33±0.61。單因素方差分析結(jié)果顯示移植后第4周、8周及12周,細胞的存活數(shù)量差異具有統(tǒng)計學意義(p0.01)。2.細胞治療組外核層厚度在移植后第4周、8周及12周分別為28.60±1.84μm,23.32±0.84μm,19.82±1.18μm,與偽手術組視網(wǎng)膜外核層厚度7.12±1.01μm,6.70±0.52μm,4.22±0.73μm相比較,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。野生型大鼠視網(wǎng)膜外核層厚度在同周齡分別為44.74±1.31μm,44.84±1.92μm,45.82±3.29μm。細胞治療組與野生型大鼠組相比較,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。3.細胞治療組在移植前,移植后第4周、8周和12周的ergb波幅值分別為76.51±1.60μv,72.47±8.03μv,44.37±10.77μv和8.40±1.99μv;偽手術組在移植前,移植后第4周、8周和12周ergb波幅值分別為77.28±2.33μv,39.08±3.88μv,18.20±5.51μv和6.13±0.86μv。移植手術進行前及移植治療手術后第12周,細胞治療組與偽手術組ergb波波幅相比較,差異無無統(tǒng)計學意義(p0.05),移植治療手術后第4周及8周,細胞治療組與偽手術組ergb波波幅相比較,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。4.安全性實驗結(jié)果顯示實驗組和陽性對照組均未出現(xiàn)免疫排斥反應,實驗組小鼠均未見畸胎瘤形成,陽性對照組出現(xiàn)畸胎瘤,發(fā)生率為33.3%。結(jié)論:1.人胚胎干細胞來源的視網(wǎng)膜前體細胞在RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔可以存活、遷移,細胞的存活數(shù)量隨移植時間的延長而減少。2.人胚胎干細胞來源的視網(wǎng)膜前體細胞在一定程度上保護RCS大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu),延緩視網(wǎng)膜外核層的變性、萎縮和視網(wǎng)膜光感受器細胞的凋亡。3.人胚胎干細胞來源的視網(wǎng)膜前體細胞對RCS大鼠的ERG結(jié)果有一定的改善作用。4.初步安全性實驗未發(fā)現(xiàn)hESC來源的RPC具有致瘤性,安全性檢測尚需進一步的研究。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R774.1

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6 新訊;視網(wǎng)膜自我修復研究有突破[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2007年

7 玉淑 編譯;“ＯＴＸ２”基因控制視網(wǎng)膜視細胞生長[N];大眾科技報;2003年

8 聞聲;英國：試驗視網(wǎng)膜疾病基因療法[N];中國醫(yī)藥報;2007年

9 保健時報實習記者 沈娜;讓我們的雙眸明亮依然[N];保健時報;2013年

10 英文化;微型機器醫(yī)生執(zhí)行重大醫(yī)療任務[N];科技日報;2004年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 邵敬芝;人胚胎干細胞來源視網(wǎng)膜前體細胞生物學特性的實驗研究[D];鄭州大學;2017年

2 許慧芳;人胚胎干細胞的優(yōu)化培養(yǎng)以及向神經(jīng)干細胞的分化研究[D];華中科技大學;2009年

3 俞妍慧;組織因子在人胚胎干細胞誘導分化過程中表達及調(diào)控的研究[D];中南大學;2013年

4 周兟;維持人胚胎干細胞不分化的鼠飼養(yǎng)層細胞標準化操作的建立與殘留的絲裂霉素C對人胚胎干細胞基因組穩(wěn)定性影響的研究[D];中南大學;2009年

5 焦淑潔;血管內(nèi)皮生長因子在人胚胎干細胞神經(jīng)分化過程中的作用及相關機制研究[D];華中科技大學;2009年

6 尹明;基于基因打靶技術的人胚胎干細胞向功能性肝細胞分化的研究[D];吉林大學;2014年

7 劉雨瀟;人胚胎干細胞向造血細胞誘導分化的研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2008年

8 徐晨明;人胚胎干細胞建系及線粒體和細胞骨架的分布模式與胚胎干細胞分化關系的研究[D];浙江大學;2008年

9 蘇位君;人胚胎干細胞來源內(nèi)皮細胞作為細胞載體對轉(zhuǎn)移性乳腺癌進行靶向治療的研究[D];南開大學;2012年

10 方貞付;人胚胎干細胞和兔胚胎干細胞的建系與鑒定[D];中國科學院研究生院（上海生命科學研究院）;2005年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 韋東;人胚胎干細胞相關發(fā)明可專利性研究[D];華東政法大學;2011年

2 王丹;三氯乙烯抑制人胚胎干細胞向心肌分化的機制研究[D];蘇州大學;2015年

3 吳一湘;酪氨酸促進人胚胎干細胞向視網(wǎng)膜色素上皮高效分化的研究[D];天津醫(yī)科大學;2015年

4 馬永賓;人胚胎干細胞源間充質(zhì)干細胞分泌的微囊泡對大鼠坐骨神經(jīng)損傷修復研究[D];江蘇大學;2016年

5 李奇;人胚胎干細胞凍存體系的優(yōu)化及其向視網(wǎng)膜上皮細胞的分化研究[D];吉林大學;2016年

6 鄭良棟;人胚胎干細胞抗腫瘤作用的體外初步研究[D];重慶醫(yī)科大學;2016年

7 呂林潔;人胚胎干細胞分化為可自我更新的神經(jīng)干細胞[D];第二軍醫(yī)大學;2016年

8 曾玉曉;二維和三維誘導的人胚胎干細胞來源RPE細胞的生物學特性比較研究[D];第三軍醫(yī)大學;2016年

9 韓兵;原始生殖細胞來源的人胚胎干細胞分離、培養(yǎng)與鑒定[D];重慶醫(yī)科大學;2004年

10 耿嘉tD;人胚胎干細胞建系相關影響因素研究[D];鄭州大學;2007年

本文編號：1315564