本文關(guān)鍵詞：葛根素對自發(fā)性高血壓大鼠血壓的干預(yù)作用及機制研究　出處：《中國中醫(yī)科學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：心腦血管病是目前我國發(fā)病率、致殘率和死亡率最高的疾病,而高血壓是心腦血管病的主要危險因素之一。高血壓病的發(fā)病機制復(fù)雜,有多種學(xué)說,如腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)激活、交感神經(jīng)系統(tǒng)活性增強、腎性水鈉潴留、內(nèi)皮細胞功能損傷等是高血壓病主要學(xué)說。血管內(nèi)皮細胞與平滑肌細胞構(gòu)成血管壁的主要部分,在維持血管張力及維持血管正常生理功能中至關(guān)重要,故本研究主要以主動脈為載體,研究葛根素的降壓機制。近些年來,越來越多的證據(jù)表明氧化應(yīng)激及其相關(guān)的氧化損傷是影響血管張力,參與高血壓病發(fā)生發(fā)展的主要原因之一。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)主要由血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞分泌,是合成一氧化氮(nitricoxide,NO)的特異酶,在維持血管舒縮功能、抗氧化損傷、保護內(nèi)皮功能、抗血小板黏附聚集等多種生理病理過程中發(fā)揮作用。因此,研究eNOS及相關(guān)基因在降壓及血管保護中的作用,對于高血壓病的防治具有重要意義。近幾十年來,高血壓病的發(fā)病機制及抗高血壓藥物研究取得了一定進展,臨床常用降壓藥在降低血壓和防治靶器官損害等方面取得較好療效。但也存在一些不足,如副作用多、終身服藥、禁忌癥多、部分藥物聯(lián)合使用受限等使藥物的臨床應(yīng)用受到了一定限制,部分患者的血壓指標不能令人滿意。中醫(yī)藥對高血壓病的研究取得了許多成果,得到了越來越多學(xué)者的關(guān)注,在調(diào)節(jié)機體整體平衡、控制血壓水平穩(wěn)定等方面發(fā)揮著獨特的優(yōu)勢,其防治高血壓病作用的多效性、增效減副性、多靶點性、前瞻性、穩(wěn)定持久性均體現(xiàn)出了中醫(yī)藥特色。葛根始載于我國最早的中藥學(xué)著作《神農(nóng)本草經(jīng)》中,距今已有近2000年歷史�，F(xiàn)代中藥學(xué)在繼承前人經(jīng)驗的基礎(chǔ)上,將葛根歸為解表藥,認為其有解肌退熱、透疹、生津止渴、升陽止瀉的作用。葛根素注射劑的上市及臨床應(yīng)用是一重大突破。藥理學(xué)發(fā)現(xiàn),葛根素注射液有降低心肌耗氧量、擴張心腦血管、增強心肌收縮、改善微循環(huán)等功效,在冠心病、心肌缺血再灌注損傷、缺血性腦卒中、高血壓病、老年性癡呆等心腦血管疾病的治療中均發(fā)揮有效作用。本研究以自發(fā)性高血壓大鼠為模型,主要研究葛根素注射液的降壓機制。實驗在第一部分借助qPCR陣列批量、精確的優(yōu)勢,初步篩選葛根素降壓有效靶點。結(jié)果提示葛根素降壓機制與增加eNOS活性、激活eNOS/cGMP通路密切相關(guān)�；诖�,為進一步研究影響eNOS活性的因素,在實驗第二部分,首先借助網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫,檢索并得到與eNOS相關(guān)的基因,之后借助qPCR陣列技術(shù),進一步研究葛根素降壓及血管保護機制。本研究分為兩部分:文獻綜述和實驗研究。1文獻綜述:該部分從葛根的古今研究進展、葛根素防治高血壓病的臨床和基礎(chǔ)研究進展、高血壓與氧化應(yīng)激三部分進行綜述。2實驗研究:包括以下兩部分:研究一葛根素對自發(fā)性高血壓大鼠血壓的干預(yù)作用及機制初探目的:探討葛根素對自發(fā)性高血壓大鼠血壓的干預(yù)作用及機制。方法:60只自發(fā)性高血壓大鼠隨機分為模型組(生理鹽水,腹腔注射給藥)、氯沙坦鉀組(每天按32.5mg.Kg-1灌胃給藥)、常規(guī)劑量葛根素組(每天按40mg·kg-1腹腔注射)和高劑量葛根素組(每天按80mg·kg-1腹腔注射),以Wistar-Kyoto(WKY)大鼠做為正常對照組(生理鹽水,腹腔注射給藥),每組15只,連續(xù)給藥10周。每周對大鼠收縮壓、舒張壓及心率進行檢測。超聲心動圖檢測大鼠主動脈內(nèi)徑及心功能,以HE染色、馬松染色觀察藥物對大鼠主動脈病理組織形態(tài)學(xué)影響,并檢測大鼠血漿腎素-血管緊張素Ⅱ-醛固酮水平,以qPCR陣列技術(shù)檢測主動脈高血壓相關(guān)基因mRNA水平的變化,繼而借助String及KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫對差異基因進行網(wǎng)絡(luò)分析。用酶聯(lián)免疫吸附法和免疫蛋白印跡技術(shù)驗證目的基因在蛋白水平的變化。結(jié)果:模型組收縮壓、舒張壓較對照組明顯升高(P0.001);與模型組比較,高劑量葛根素組、氯沙坦鉀組收縮壓、舒張壓均顯著降低(P0.05或P0.01);給藥9周后,模型組心率較對照組明顯增加(P0.05),高劑量、常規(guī)劑量葛根素組心率與模型組比較明顯降低(P0.01),氯沙坦鉀組心率未見明顯變化(P0.05)。模型組主動脈內(nèi)徑較對照組明顯增寬(P0.001);氯沙坦鉀組主動脈內(nèi)徑較模型組顯著變窄(P0.05),葛根素組較模型組未見明顯差異(P0.05),但有減小趨勢。模型組EF值、FS值較對照組均明顯降低(P0.01);葛根素高劑量、常規(guī)劑量組EF、FS值較模型組明顯升高(P0.001),氯沙坦鉀組較模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。模型組大鼠主動脈內(nèi)中膜厚度較對照組明顯增加(P0.001);與模型組比較,氯沙坦鉀組、葛根素高劑量、葛根素常規(guī)劑量組內(nèi)中膜厚度均顯著降低(P0.001)。模型組血漿腎素、血管緊張素ⅡI水平與對照組比較均未見統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);常規(guī)劑量、高劑量葛根素組血管緊張素Ⅱ水平較模型組顯著降低(P0.05或P0.01),且較氯沙坦鉀組降低更為明顯(P0.01);氯沙坦鉀組血管緊張素Ⅱ水平較模型組升高(P0.05);與模型組比較,給藥組均能顯著降低大鼠血漿中腎素水平(P0.01);各組間醛固酮水平未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。對qPCR陣列篩選得到的18個差異表達基因進行網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn),eNOS與Cav1、Agtr1b關(guān)系密切;此外,Adrb1、Agtr1b、Gucy 1 a3、Gucy 1 b3、Kcnmal、Mylk、Mylk3、eNOS、Pde3a、Pde5a 均參與 cGMP/PKG通路的活化;Agtr1b、Gucy1a3、Gucy1b3、Kcnmal、Mylk、Mylk3、Ptgir 參與血管平滑肌收縮;Gucy1a3、Gucy1b3、Mylk、Mylk3、eNOS、Ptgir 均與血小板活化有關(guān)。用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中cGMP、PGI2水平,發(fā)現(xiàn)模型組血清中cGMP、PGI2水平較對照組均明顯下降(P0.05);與模型組相比,氯沙坦鉀組、高劑量及常規(guī)劑量葛根素組cGMP、PGI2水平均明顯升高(P0.01或P0.001)。免疫蛋白印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn),模型組p-eNOS水平較對照組明顯降低(P0.01);與模型組比較,高劑量葛根素組p-eNOS水平明顯升高(P0.05),氯沙坦鉀組無明顯統(tǒng)計意義,但較模型組有升高趨勢(P0.05)。各組eNOS總蛋白表達量無明顯差異(P0.05)。模型組Agtr1蛋白表達量較對照組明顯升高(P0.01),氯沙坦鉀、高劑量葛根素干預(yù)后能明顯降低主動脈Agtr1蛋白水平(P0.01)。各組間Agtr2蛋白水平無明顯差異(P0.05)。結(jié)論:葛根素降低自發(fā)性高血壓大鼠血壓,其機制與增加eNOS活性密切相關(guān)。葛根素通過下調(diào)Cav1、Agtr1b表達量,影響eNOS活性,此外eNOS/cGMP通路參與葛根素對血壓的調(diào)節(jié)。研究二基于eNOS相關(guān)基因,進一步探討葛根素的降壓機制目的:基于eNOS在血壓調(diào)控中的作用,探討葛根素對主動脈的保護作用及機制。方法:自發(fā)性高血壓大鼠隨機分組后,分別給藥葛根素和氯沙坦鉀,連續(xù)給藥10周后,以生化法檢測大鼠血清中NO、MDA、O2..水平及SOD含量,酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血清中eNOS水平,以qPCR陣列技術(shù)檢測主動脈eNOS互作基因的變化,繼而借助String及KEGGPathway數(shù)據(jù)庫對差異基因進行網(wǎng)絡(luò)分析,并檢測目的基因蛋白水平變化。結(jié)果:給藥10周后,模型組血清NO水平較對照組顯著降低(P0.001),高劑量葛根素組、氯沙坦鉀組大鼠NO水平較模型組顯著升高(P0.01或P0.001)。與對照組比較,模型組MDA水平明顯升高(P0.001);與模型組比較,常規(guī)劑量、高劑量葛根素組和氯沙坦鉀組MDA水平明顯降低(P0.01或P0.001)。模型組O2-·水平較對照組顯著升高(P0.001),給藥組各組間O2-·水平較模型組無明顯差異(P0.05),但有降低趨勢。各組間SOD含量較模型組無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。模型組血清eNOS水平較對照組明顯降低(P0.001),與模型組比較,氯沙坦鉀組、高劑量葛根素組及常規(guī)劑量葛根素組eNOS水平明顯增加(P0.001或P0.01)。對qPCR陣列篩選得到的12個差異表達基因進行網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn),eNOS與HSP90β1、Cav1關(guān)系密切。此外,葛根素還影響Decr1、Gpx2、Prdx5、Prdx3等氧化酶的表達,參與PI3K/Akt、雌激素通路和黏著斑的調(diào)節(jié)。免疫蛋白印跡結(jié)果提示,模型組Hsp90蛋白表達水平較對照組明顯升高(P0.05),氯沙坦鉀組、葛根素組Hsp90蛋白水平較模型組顯著降低(P0.05或P0.001)。模型組與對照組比較,PI3K蛋白表達量無明顯變化,但有降低趨勢;氯沙坦鉀、高劑量葛根素組PI3K蛋白表達量較模型組明顯升高(P0.001或P0.01)。各組間Akt及p-Akt蛋白水平均無明顯變化(P0.05)。結(jié)論:葛根素可明顯降低大鼠血清中MDA水平,升高NO、eNOS水平;eNOS活性受Hsp90、Hsp70及Nox調(diào)節(jié)。此外,葛根素通過增強抗氧化酶系統(tǒng)的防御功能,調(diào)控PI3K/Akt通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和降壓作用。
【學(xué)位授予單位】：中國中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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