發(fā)布時間：2017-12-20 10:13

  本文關(guān)鍵詞：FBXW7與EBP1異構(gòu)體的差異性相互作用調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展　出處：《山東大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：大腸癌是最常見的惡性腫瘤之一,是引起癌癥相關(guān)死亡的第五位主要因素。雖然手術(shù)切除并輔以化學治療和放射治療的多模式組合治療方法已經(jīng)應用于不同階段大腸癌的治療,但目前大腸癌患者的死亡率仍然較高。盡管目前很多研究致力于大腸癌的早期診斷和靶向治療,但仍缺少較為有效的生物標志物及預測指標。因此,進一步研究并明確有效的腫瘤標志物及治療靶標對于提高大腸癌患者的生存率至關(guān)重要。表皮生長因子受體 ErbB3 結(jié)合蛋白(ErbB3 receptor binding protein 1,EBP1)是PA2G4蛋白家族成員,廣泛表達于人類組織并參與調(diào)控細胞生長、細胞分化和細胞凋亡。研究表明EBP1有兩個亞型,分別為P48和P42。由于EBP1基因的選擇性剪切,P48亞型比P42亞型在N-端多54個氨基酸,這導致EBP1 P48和EBP1 P42有不同的生物學功能。EBP1 P48在細胞質(zhì)和細胞核中均有表達,能促進細胞增殖并抑制細胞分化。研究報道在胰腺癌、宮頸癌和前列腺癌中EBP1 P48均表達增高,且高表達的EBP1 P48與腫瘤不良預后相關(guān),提示EBP1 P48能促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。與EBP1 P48的原癌基因作用相反,EBP1 P42通過抑制細胞增殖和促進細胞分化而發(fā)揮抑癌基因作用。雖然目前已經(jīng)明確EBP1 P48有癌基因活性而EBP1 P42主要發(fā)揮抑癌基因功能,但EBP1不同亞型在腫瘤中發(fā)揮不同生物學功能的調(diào)控機制尚不明確。FBXW7(F-box and WD repeat domain-containing7)屬于 F-box 蛋白家族,是 SCF(Skp1/Cul1/F-box)E3泛素連接酶復合體的靶蛋白識別組分。FBXW7包含兩個重要的功能結(jié)構(gòu)域:F-box結(jié)構(gòu)域和WD40結(jié)構(gòu)域;F-box結(jié)構(gòu)域可與Skp1結(jié)合形成SCFFBXW7復合體,WD40結(jié)構(gòu)域識別并結(jié)合特異性磷酸化底物(CPD),介導靶蛋白的泛素化降解。FBXW7在多種腫瘤中存在表達缺失或突變,其表達減低或功能缺失誘導腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究報道FBXW7主要通過靶向泛素化降解癌蛋白發(fā)揮其抑癌作用,包括cyclin E,Notch,mTOR,Aurora-A和c-Myc等,從而參與調(diào)控細胞周期進程、細胞增殖、細胞分化、DNA損傷應答和基因組穩(wěn)定性維持。作為腫瘤抑制基因,FBXW7的抑癌作用已被廣泛研究,然而目前對于FBXW7靶底物的鑒定及FBXW7表達缺失誘導腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制研究并不充分。理解并研究FBXW7的生物學功能和新的作用網(wǎng)絡對于研究其抑癌作用和進一步研發(fā)靶向藥物具有重要意義。本研究主要探討FBXW7與EBP1亞型的差異性相互作用及作用機制,明確FBXW7差異性調(diào)控EBP1亞型在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及意義。本研究的完成不僅進一步明確了 FBXW7的腫瘤生物學功能,也為探索以FBXW7為靶標的早期診斷指標及治療靶點提供了理論依據(jù)。第一部分FBXW7差異性調(diào)控EBP1亞型表達及機制研究[目的]應用雙向凝膠電泳(2-DE)和質(zhì)譜分析技術(shù)(MS)鑒定FBXW7新的靶底物,分析FBXW7對新鑒定靶底物的表達調(diào)控并明確調(diào)控機制,為進一步研究FBXW7的生物學功能和新的調(diào)控通路奠定基礎(chǔ)。[方法]1.FBXW7新靶底物鑒定1.1應用HCT116 FBW7+和FBBW7-/-細胞系,采用2-DE和MS分析FBXW7的新靶蛋白。1.2在人乳腺癌細胞MDA-MB-468、人前列腺癌細胞DU145和PC3中,通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染 pSuper-puro-shFBXW7 A、pSuper-puro-shFBXW7 B 及其空 白 對照質(zhì)粒,構(gòu)建FBXW7穩(wěn)定低表達的細胞株及其對照組細胞。應用qRT-PCR和Western blot分別檢測所構(gòu)建細胞系中FBXW7 mRNA及蛋白的表達,同時檢測FBXW7新鑒定靶蛋白EBP1的表達。1.3 構(gòu)建 Myc-EBPl P48 和 Myc-EBP1 P42 表達質(zhì)粒,分別與 HA-FBXW7α 或HA-FBXW7α△F(F-box 缺失)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染 HEK293T 細胞,Western blot 檢測FBXW7對EBP1不同亞型的表達調(diào)控。2.FBXW7對EBP1 P48的降解及機制研究2.1 Myc-EBP1 P48 分別與 HA-Vector 或 HA-FBXW7α 共同轉(zhuǎn)染 HEK293T 細胞,應用蛋白質(zhì)合成抑制劑放線菌酮(cycloheximide,CHX,50μg/ml)分別處理細胞Oh,1.5h,4h,6h,8h,Western blot 檢測 FBXW7 對外源 EBP1P48 半衰期的影響。同樣方法處理HCT116F FBXW7+/+、HCT116FBXW7-/-和DLD-1 FBXW7+/+、DLD-1 FBXW7-/-細胞,Western blot進一步檢測FBXW7對內(nèi)源EBP1 P48半衰期的影響。2.2 Myc-EBP1 P48 分別與 HA-Vector 或 HA-FBXW7α 共同轉(zhuǎn)染 HEK293T 細胞,分別應用CHX或CHX與蛋白酶體抑制劑MG132(10μM)共同處理細胞6h,Western blot檢測MG132是否抑制FBXW7對EBP1 P48的降解。同樣方法處理HCT116FBXW7+/+、HCT116FBXW7-/-和DLD-1FBXW7++、DLD-11FBXW7-/-細胞,Western blot進一步驗證MG132對FBXW7降解EBP1 P48的影響。2.3 Flag-EBP1 P48、HA-Ubiquitin 和 Myc-FBXW7α 共同轉(zhuǎn)染 HEK293T 細胞,免疫沉淀實驗檢測FBXW7對EBP1 P48泛素化的影響。同時在HCT116 FBXW7+/+、HCT116 FBXW7-/-細胞中分別轉(zhuǎn)染HA-Ubiquitin,免疫沉淀實驗檢測不伺FBXW7表達量對EBP1 P48泛素化水平的影響。2.4 Flag-EBP1 P48轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,免疫共沉淀實驗檢測EBP1 P48與GSK3β是否結(jié)合。2.5 Myc-EBP1 P48與HA-FBXW7α共同轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,其中一組細胞應用GSK3β抑制劑Ⅶ進行處理,Western blot檢測GSK3β抑制劑VⅦ對FBXW7降解EBP1 P48的影響。同樣方法處理HCT116 FBXW7+/+和HCT116 FBXW7-/-細胞,Western blot進一步驗證FBXW7對EBP1 P48的降解是否依賴于GSK3β對EBP1 P48的磷酸化。2.6 HA-Ubiquitin轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,同時應用GSK3β抑制劑Ⅷ處理細胞,免疫沉淀實驗檢測GSK3β抑制劑Ⅷ是否影響EBP1 P48的泛素化水平。3.檢測FBXW7是否與EBP1 P48相互結(jié)合并確定結(jié)合位點3.1檢測FBXW7與EBP1 P48的相互結(jié)合HA-Vector 或 HA-FBXW7α 分別與 Flag-EBPl P48 共同轉(zhuǎn)染 HEK293T 細胞,免疫共沉淀檢測FBXW7與EBP1 P48的結(jié)合。同時應用免疫共沉淀實驗檢測HCT116細胞中內(nèi)源FBXW7與內(nèi)源EBP1 P48的結(jié)合。3.2檢測FBXW7與EBP1 P48結(jié)合的功能位點3.2.1 HA-FBXW7α,HA-FBXW7α△F、HA-FBXW7α△WD(WD40 結(jié)構(gòu)域表達缺失)和 HA-FBXW7αWD 結(jié)構(gòu)域點突變質(zhì)粒(R465C、R465H、R479H、R505C)分別與F1ag-EBPl P48共同轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,免疫共沉淀實驗檢測FBXW7表達缺失或突變質(zhì)粒與EBP1 P48的結(jié)合,確定FBXW7與EBP1 P48結(jié)合的功能片段。3.2.2根據(jù)3.2.1中確定的FBXW7功能片段,將缺失該片段的FBXW7與Flag-EBPl P48和Myc-Ubiquitin共同轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,免疫沉淀實驗檢測其對EBP1 P48泛素化的影響,同時應用Western blot檢測FBXW7缺失該片段后對EBP1 P48蛋白表達的影響。3.3分析EBP1 P48與FBXW7相互作用的功能位點3.3.1應用磷酸位點分析軟件分析EBP1 P48蛋白序列中可能的GSK3β磷酸化位點,根據(jù)預測結(jié)果構(gòu)建EBP1 P48表達缺失質(zhì)粒Myc-EBPl P48△40-44和Myc-EBPl P48△88-94。3.3.2 HA-FBXW7α 分別與 Myc-EBPl P48A40-44 或 Myc-EBPl P48A88-94 共同轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,免疫共沉淀檢測EBP1 P48△40-44或EBP1 P48A88-94與FBXW7的結(jié)合。3.3.3 HA-FBXW7α 分別與 Myc-EBPl P48△40-44 或 Myc-EBPl P48A88-94 共同轉(zhuǎn)染 HEK293T 細胞,Western blot 檢測 FBXW7 對 Myc-EBPl P48A40-44 或Myc-EBP1 P48A88-94蛋白表達的影響。同時應用CHX處理細胞,Western blot進一步檢測 FBXW7 對 Myc-EBP1 P48A40-44 或 Myc-EBP1 P48△88-94 半衰期的影響。3.3.4 Myc-EBP1P48△40-或 Myc-EBP1 P48A88-94 分別與HA-FBXW7 共同轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,應用CHX或CHX與MG132共同處理細胞6h,Western blot檢測在 MG132 作用下 FBXW7α 對 Myc-EBP1 P48△40-44 或 Myc-EBP1 P48A88-94蛋白表達的影響。3.3.5根據(jù)上述結(jié)果明確EBP1 P48功能片段,構(gòu)建針對該片段的EBP1 P48點突變質(zhì)粒Flag-EBP1 P48S40A,將該質(zhì)粒與FBXW7共同轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,Western blot檢測FBXW7對EBP1 P48S40A蛋白表達的影響。3.3.6 Flag-EBP1 P48S40A 與 HA-FBXW7α 共同轉(zhuǎn)染 HEK293T 細胞,免疫共沉淀檢測FBXW7與EBP1 P48S40A是否結(jié)合。3.3.7 HA-Vector 或 HA-FBXW7α 分別與 Flag-EBP1 P48S40A 和 Myc-Ubiquitin 共同轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,免疫沉淀實驗檢測FBXW7是否影響EBP1 P48S40A的泛素化水平。[結(jié)果]1.FBXW7差異性調(diào)控EBP1亞型的表達。1.1 2-DE和MS實驗提示EBP1為FBXW7新的靶蛋白。1.2成功構(gòu)建MDA-MB-468、DU145和PC3穩(wěn)定低表達FBXW7細胞系,qRT-PCR和Western blot驗證細胞系構(gòu)建成功;FBXW7低表達能明顯上調(diào)EBP1 P48的表達量,而對EBP1 P42的表達量無影響。1.3高表達FBXW7能顯著降低EBP1 P48的蛋白表達,而對EBP1 P42的蛋白表達無影響。2.FBXW7以GSK3β依賴方式泛素化降解EBP1 P48。2.1在CHX作用下,高表達FBXW7能顯著縮短EBP1 P48半衰期,而HCT116細胞中FBXW7表達缺失顯著延長EBP1 P48半衰期。2.2應用蛋白酶體抑制劑MG132能阻斷FBXW7對EBP1 P48的降解。2.3 FBXW7能促進EBP1 P48的泛素化水平。2.4 EBP1 P48 與 GSK3β 相互結(jié)合。2.5 FBXW7對EBP1 P48的降解依賴于GSK3β對EBP1 P48的磷酸化。2.6GSK3β抑制劑Ⅷ能抑制EBP1 P48的泛素化水平。3.FBXW7通過其WD40結(jié)構(gòu)域與EBP1 P48 S40相互結(jié)合。3.1 FBXW7 與 EBP1 P48 相互結(jié)合。3.2 FBXW7通過其WD40結(jié)構(gòu)域與EBP1 P48結(jié)合,缺失WD40結(jié)構(gòu)域影響FBXW7對EBP1 P48的泛素化降解。3.3 EBP1 P48通過其第40位絲氨酸位點與FBXW7相結(jié)合3.3.1 成功構(gòu)建 EBP1 P48 表達缺失質(zhì)粒 Myc-EBP1 P48△40-44 和 Myc-EBP1 P48△88-94。3.3.2 EBP1 P48缺失第40-44位氨基酸后不能與FBXW7結(jié)合,而缺失第88-94位氨基酸仍然可以與FBXW7結(jié)合。3.3.3 FBXW7能降低EBP1 P48A88-94的蛋白表達且明顯縮短其半衰期,而對EBP1 P48A40-44的蛋白表達和半衰期無影響。3.3.4 MG132 能阻斷 FBXW7 對 EBP1 P48A88-94 的降解,而對 EBP1 P48A40-44的表達無影響。3.3.5成功構(gòu)建Flag-EBP1 P48S40A(絲氨酸突變?yōu)楸彼?質(zhì)粒。Western blot結(jié)果表明FBXW7對EBP1 P48S40A的蛋白表達無影響。3.3.6 FBXW7 與 EBP1 P48S40A 不結(jié)合。3.3.7 FBXW7不能影響EBP1 P48S40A的泛素化水平。[結(jié)論]1.FBXW7差異性調(diào)控EBP1亞型的表達2.EBP1 P48是FBXW7的靶底物:FBXW7通過泛素-蛋白酶體途徑降解EBP1 P48,且這一降解作用依賴于GSK3β對EBP1 P48的磷酸化作用。3.FBXW7與EBP1 P48相互結(jié)合:FBXW7通過WD40結(jié)構(gòu)域與EBP1 P48結(jié)合,而EBP1 P48通過第40位絲氨酸位點與FBXW7結(jié)合。第二部分EBP1 P48介導FBXW7對大腸癌細胞的作用及機制研究[目的]第一部分研究結(jié)果表明FBXW7靶向調(diào)控EBP1 P48蛋白表達,本部分通過體外細胞實驗和裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤模型檢測FBXW7對大腸癌細胞增殖、遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移的抑制作用是否通過EBP1 P48介導,并探討EBP1 P48介導FBXW7功能的分子機制。[方法]1.在HCT116FBXW7-/-細胞中特異性干擾EBP1 P48的表達,通過MTT實驗和克隆形成實驗檢測細胞增殖能力的改變;通過細胞劃痕實驗、Transwell實驗檢測干擾EBP1 P48的表達對細胞遷移能力的影響;通過Matrigel實驗檢測干擾EBP1 P48的表達對細胞侵襲能力的影響。2.應用HCT116FBBW7+/+、FBXXW7-/-和FBXW7-/-shEBP1 P48細胞系建立裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤模型,通過HE染色檢測腫瘤轉(zhuǎn)移情況,研究FBXW7表達缺失引起的腫瘤轉(zhuǎn)移是否通過EBP1 P48介導。3.應用免疫組織化學染色檢測大腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織中FBXW7和EBP1P48的表達,并分析其表達相關(guān)性。4.HA-FBXW7α和F1ag-EBP1 P48共同轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,分別提取細胞質(zhì)蛋白和細胞核蛋白,Western blot檢測EBP1 P48是否影響FBXW7的細胞內(nèi)定位;同時應用免疫熒光實驗進行進一步驗證。5.HCT116FBXW7+/+、FBXW7-/-細胞中分別轉(zhuǎn)染EBP1 P48,應用qRT-PCR和Western blot分別檢測EBP1 P48對FBXW7靶底物mRNA和蛋白表達的影響。6.HA-FBXW7α和Flag-EBP1 P48共同轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,免疫共沉淀檢測EBP1 P48是否抑制FBXW7與已知靶底物的結(jié)合。[結(jié)果]1.HCT116FBXW7-/-細胞中干擾EBP1 P48的表達能逆轉(zhuǎn)因FBXW7表達缺失引起的大腸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的改變。2.裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤實驗表明干擾EBP1 P48表達能抑制FBXW7表達缺失引起的大腸癌細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的改變。3.與正常組織相比,大腸癌組織中FBXW7表達明顯減低,而EBP1P48表達明顯增高,統(tǒng)計學分析提示兩者表達量呈負相關(guān)。4.EBP1 P48促進FBXW7由細胞核向細胞質(zhì)移位。5.EBP1 P48抑制FBXW7對靶底物的降解。6.EBP1 P48抑制FBXW7與靶底物的結(jié)合。[結(jié)論]1.EBP1 P48介導FBXW7表達缺失引起的大腸癌細胞增殖、遷移、侵襲及體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的改變。2.EBP1 P48能促進FBXW7由細胞核向細胞質(zhì)移位,從而抑制FBXW7與靶底物的結(jié)合,進而抑制FBXW7對靶底物的降解。第三部分EBP1 P42促進FBXW7對大腸癌細胞的抑癌作用及機制研究[目的]第一部分結(jié)果表明FBXW7對EBP1 P42蛋白表達沒有影響,但EBP1 P42作為EBP1的一個亞型是否與EBP1 P48 一樣參與FBXW7功能調(diào)控還未知。該部分擬通過一系列實驗研究EBP1 P42與FBXW7是否有相互作用,明確EBP1 P42與FBXW7的相互作用對大腸癌細胞生物學功能的影響。[方法]1.HA-Vector 或 HA-FBXW7α 分別與 Flag-EBP1 P42 共同轉(zhuǎn)染 HEK293T 細胞,免疫共沉淀檢測FBXW7與EBP1 P42是否結(jié)合。2.HA-FBXW7α,HA-FBXW7α△F、HA-FBXW7α△WD、HA-FBXW7αN△F(F-box和WD40結(jié)構(gòu)域均缺失)和HA-FBXW7αWD結(jié)構(gòu)域點突變質(zhì)粒(R465C、R465H、R479H、R505C)分別與Flag-EBP1 P42共同轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,免疫共沉淀實驗檢測FBXW7表達缺失或突變質(zhì)粒與EBP1 P42的結(jié)合,確定FBXW7與EBP1 P42結(jié)合的功能片段。3.根據(jù)上述結(jié)果構(gòu)建HA-FBXW7α△FR465C(F-box結(jié)構(gòu)缺失且WD40結(jié)構(gòu)域第465位氨基酸突變)質(zhì)粒,將該質(zhì)粒與Flag-EBP1 P42共同轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,免疫共沉淀檢測兩者是否相互結(jié)合。4.HA-FBXW7α、Myc-FBXW7α 和 Flag-EBP1 P42 共同轉(zhuǎn)染 HEK293T 細胞,免疫共沉淀檢測EBP1 P42是否影響FBXW7的二聚化,同時檢測EBP1 P42是否影響FBXW7與已知靶底物的結(jié)合。5.HCT116 FBXW7+/+、FBXW7-/-細胞中分別轉(zhuǎn)染EBP1 P42,應用qRT-PCR和Western blot分別檢測EBP1 P42對FBXW7靶底物mRNA和蛋白表達的影響。6.HA-FBXW7α 分別與 Flag-Vector 或 Flag-EBP1 P42 共同轉(zhuǎn)染 HCT116FBXW7-/-細胞,通過MTT實驗、克隆形成實驗、劃痕實驗、Transwell遷移實驗和Matrigel侵襲實驗檢測EBP1 P42是否能增強FBXW7的腫瘤抑制作用。[結(jié)果]1.FBXW7與EBP1 P42相互結(jié)合。2.FBXW7可通過F-box結(jié)構(gòu)域直接與EBP1 P42結(jié)合。3.FBXW7靶底物介導EBP1 P42與FBXW7 WD40結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。4.EBP1 P42促進FBXW7二聚化并增強FBXW7與靶底物的結(jié)合。5.EBP1 P42促進FBXW7對靶底物的降解。6.EBP1 P42能增強FBXW7的腫瘤抑制作用。[結(jié)論]1.FBXW7可通過F-box結(jié)構(gòu)域直接與EBP1 P42結(jié)合,此外FBXW7靶底物可介導EBP1 P42與FBXW7 WD40結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。2.EBP1 P42能促進FBXW7二聚化,并促進FBXW7對靶底物的降解。3.EBP1 P42能增強FBXW7的抑癌作用。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.34

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Yi Luan;Ping Wang;;FBW7-mediated ubiquitination and degradation of KLF5[J];World Journal of Biological Chemistry;2014年02期

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本文編號：1311707