本文關鍵詞：益氣活血方基于Notch信號調控心肌梗死后心肌重構作用機理的研究

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【摘要】：背景與目的:心血管疾病已成為我國的重大公共衛(wèi)生問題,其中急性心肌梗死的發(fā)病率和死亡率呈快速上升態(tài)勢,經皮冠狀動脈介入治療術(percutaneous coronary intervention,PCI)是急性心肌梗死的重要治療方法,可以有效降低死亡率和再發(fā)梗死率,但是隊列研究顯示單純接受PCI患者的預后獲益并不優(yōu)于強化藥物治療的患者,且PCI不僅帶來了冠脈微循環(huán)障礙,也帶來了不同程度的心肌重構,這就提醒我們需要更加關注冠脈微循環(huán)障礙與心肌重構,努力撥慢心肌梗死后心力衰竭進展的時鐘,改善患者的預后。線粒體損傷是心肌重構發(fā)生與進展的關鍵因素,線粒體能量代謝障礙、結構功能破壞是多種線粒體損傷形式的始動環(huán)節(jié)。因此關注線粒體損傷,關注線粒體能量代謝、線粒體結構與功能,改善心肌缺血和防治心肌重構,對于預防與改善心肌梗死后心力衰竭發(fā)生發(fā)展的病理基礎有重要意義。Notch及AMP活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信號通路可以從多角度對線粒體能量代謝進行調控,保護線粒體結構和功能,有望成為臨床藥物研究與開發(fā)的新靶點。依據中醫(yī)氣血理論創(chuàng)立的益氣活血方是臨床常用治療心肌缺血的經驗方,具有益氣養(yǎng)心,活血通脈的功效。前期研究顯示本方可以有效減輕心肌梗死患者的臨床癥狀、增強心臟收縮功能,改善冠脈微循環(huán)障礙。因此,本研究將從調節(jié)線粒體能量代謝、保護線粒體結構和功能的角度,以Notch及AMPK信號通路為橋梁,觀察益氣活血方防治心肌重構的作用機制。方法:結扎大鼠冠狀動脈左前降支復制心肌梗死動物模型,術后第2天予以相關藥物干預,觀察7天、28天兩個時間節(jié)點相關指標變化情況。本研究分為四個實驗:實驗一、二、三隨機將造模成功大鼠分為心肌梗死組、益氣活血方組、培哚普利組、DAPT(γ分泌酶抑制劑,Notch信號抑制劑)組、Notch抑制劑+益氣活血方組,并設置假手術組。運用超聲心動觀察各時間節(jié)點大鼠心臟結構和功能變化,運用HE染色觀察心肌細胞形態(tài)學變化,以評價各組大鼠成模情況及左心室重塑程度。通過蛋白印跡法及實時熒光定量法分別檢測Notch,AMPK信號通路相關蛋白及mRNA表達,觀察Notch及AMPK信號通路交叉對話關系,揭示該交叉對話在心肌梗死后心肌重構中的作用。運用ELISA檢測大鼠血糖及游離脂肪酸變化,運用蛋白印跡法檢測葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)及乙酰輔酶A羧化酶(ACC)蛋白表達,揭示益氣活血方提高Notch1和AMPK交叉對話,通過不同作用機制動態(tài)調節(jié)心肌梗死大鼠糖脂代謝,改善線粒體能量障礙。實驗四將造模成功大鼠隨機分為心肌梗死組、益氣活血方組、培哚普利組,并設置假手術組。運用透射電鏡觀察線粒體形態(tài)結構變化;采用蛋白質印跡法檢測過氧化物酶增殖激活受體Y輔助激活因子1α(PGC-1α)、核呼吸因子1(NRF1)、線粒體轉錄因子A(mtTFA)蛋白表達變化;運用熒光酶標法檢測ATP合成情況,揭示益氣活血方保護線粒體結構和功能,從而促進ATP合成,以發(fā)揮心肌保護作用。結果:(1)心臟結構和功能:心肌梗死組大鼠心臟左室射血分數(shù)(LVEF)、左室短軸率(LVFS)明顯下降,左室收縮末期內徑(LVIDs)、左室舒張末期內徑(LVIDd)、左室收縮末期容積(ESV)、左室舒張末期容積(EDV)明顯增加(Pall0.01)。7天時,與心肌梗死組大鼠相比,益氣活血方組和培哚普利組LVEF、LVFS升高(Pall0.05),LVIDs、LVIDd、EDV、ESV縮減,但無明顯統(tǒng)計學差異(Pall0.05),Notch抑制劑組LVEF明顯下降(P0.01),LVFS率下降,LVIDs、LVIDd、EDV、ESV增加,但無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。與益氣活血方組相比,Notch抑制劑+益氣活血方組LVEF、LVFS下降(Pall0.05),LVIDs縮減、LVIDd、EDV、ESV增加,但無明顯統(tǒng)計學差異(Pall0.05)。28天時,與心肌梗死組大鼠相比,益氣活血方組LVEF、LVFS升高、EDV、ESV縮減(Pall0.05),培哚普利組LVEF、LVFS升高,EDV、ESV縮減,但無明顯統(tǒng)計學意義(Pall0.05),益氣活血方組與培哚普利組LVIDs、LVIDd縮減(Pall0.01),Notch抑制劑組LVEF、LVFS明顯下降,LVIDs、LVIDd、EDV增加(p0.05),ESV增加,但無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。與益氣活血方組相比,Notch抑制劑+益氣活血方組LVEF、LVFS降低,LVIDs、LVIDd、ESV增加(Pall0.01),EDV增加,但無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。結果表明,心肌梗死后,心臟收縮功能下降,心室重塑明顯,運用益氣活血方可以改善心臟收縮功能,減輕心室重塑程度。(2)心肌細胞形態(tài)學:假手術組大鼠心肌細胞排列整齊,紋理清晰,偶有斷裂,心肌纖維結構清楚,未見明顯炎性細胞浸潤;7天時,心肌梗死組大鼠心肌細胞排列紊亂，，紋理走向不確定,可見灶性心肌纖維走形中斷,心肌細胞核溶解、消失,大量炎性細胞浸潤。28天時,心肌梗死組大鼠心肌細胞排列紊亂,紋理走向不確定,可見大量灶性心肌纖維走形中斷,大量纖維及膠原組織增生。益氣活血方組和培哚普利組大鼠心肌細胞增生明顯,重新排列較規(guī)整,部分纖維及膠原組織增生,較心肌梗死組病變范圍減小。Notch抑制劑組心肌細胞排列紊亂,紋理走向不確定,可見大量灶性心肌纖維走形中斷,纖維及膠原組織增生較心肌梗死組擴大,Notch抑制劑+益氣活血方組病理改變與Notch抑制劑組相似,但纖維及膠原組織增生較其減輕。表明心肌梗死后,心肌細胞形態(tài)破壞明顯,運用益氣活血方可以有效減輕心肌細胞形態(tài)破壞。(3)Notch和AMPK信號通路交叉對話:7天時,與假手術組相比,心肌梗死組Notch、pLKB1、pAMPK蛋白表達下降(Pall0.01)。與心肌梗死組相比,益氣活血方組和培哚普利組 Notch、pLKB1、pAMPK 蛋白表達升高(Pall0.05),Notch 抑制劑組 Notch、pLKB1、pAMPK蛋白表達下降(Pall0.05)。與益氣活血方組相比,Notch抑制劑+益氣活血方組Notch、pAMPK蛋白表達下降(Pall0.01),pLKB1蛋白表達呈下降趨勢(P=0.056)。28天時,與假手術組相比,心肌梗死組Notch、pLKB1、pAMPK蛋白表達下降(Pall0.01)。與心肌梗死組相比,益氣活血方組和培哚普利組Notch、pLKB1、pAMPK蛋白表達升高(Pall0.01),Notch 抑制劑組 Notch、pLKB1、pAMPK 蛋白表達下降(Pall0.05)。與益氣活血方組相比,Notch抑制劑+益氣活血方組Notch、pLKB1、pAMPK蛋白表達下降(Pall0.01),表明Notch與AMPK信號通路間存在交叉對話,心肌梗死后,Notch和AMPK信號蛋白表達下降,運用益氣活血方可以增加Notch和AMPK信號蛋白表達。(4)心肌細胞能量代謝:7天時,與假手術組大鼠相比,心肌梗死組大鼠血糖、游離脂肪酸升高(Pall0.05)。與心肌梗死組大鼠相比,益氣活血方組與培哚普利組血糖、游離脂肪酸下降(Pall0.01),Notch抑制劑組血糖、游離脂肪酸升高,但無明顯統(tǒng)計意義(Pall0.05)。與益氣活血方組相比,Notch抑制劑+益氣活血方組血糖、游離脂肪酸升高(Pall0.05)。28天時,與假手術組大鼠相比,心肌梗死組大鼠血糖、游離脂肪酸升高(Pall0.01)。與心肌梗死組大鼠相比,益氣活血方組血糖、游離脂肪酸降低(Pall0.05),培哚普利組血糖降低,但無明顯統(tǒng)計學差異(P=0.252),游離脂肪酸降低明顯(P0.01),Notch抑制劑組血糖、游離脂肪酸升高(Pall0.05)。Notch抑制劑+益氣活血方組血糖、游離脂肪酸升高(Pall0.01)。7天時,與假手術組相比,心肌梗死組GLUT4,pACC蛋白表達下降(Pall0.05)。與心肌梗死組相比,益氣活血方組與培哚普利組GLUT4蛋白表達呈升高趨勢,但無明顯統(tǒng)計學差異.(Pall0.05),pACC蛋白表達升高(Pall0.05),Notch抑制劑組GLUT4蛋白表達呈降低趨勢,但無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05),pACC蛋白表達降低(P=0.004)。與益氣活血方組相比,Notch抑制劑+益氣活血方組GLUT4蛋白表達呈降低趨勢,但無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05),pACC蛋白表達降低(P=0.027)。28天時,與假手術組相比,心肌梗死組GLUT4,pACC蛋白表達下降(Pall0.05)。與心肌梗死組相比,益氣活血方組與培哚普利組GLUT4蛋白表達升高(Pall0.05),pACC蛋白表達呈升高趨勢,但無明顯統(tǒng)計學差異(Pall0.05),Notch抑制劑組GLUT4蛋白表達降低(P=0.034),pACC蛋白表達呈降低趨勢,但無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。與益氣活血方組相比,Notch抑制劑+益氣活血方組GLUT4蛋白表達降低(P=0.047),pACC蛋白表達呈降低趨勢,但無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。各組ACC蛋白表達無統(tǒng)計學差異。表明心肌梗死后,糖脂代謝紊亂,益氣活血方可以調節(jié)糖脂代謝,改善線粒體能量代謝障礙。(5)線粒體結構、功能與ATP合成:假手術組心肌纖維排列整齊且緊密,橫紋清晰可見,肌小節(jié)完整,線粒體形態(tài)正常,膜完整,嵴清晰;7天時,心肌梗死組心肌細胞肌絲排列嚴重紊亂肌纖維走形不規(guī)則、斷裂,可見肌原纖維溶解消失,線粒體形態(tài)大小不等,部分空泡化明顯,界膜破裂,嵴模糊不清,嵴間基質密度增高。28天時,心肌梗死組心肌細胞肌絲排列嚴重紊亂,肌纖維走形不規(guī)則、斷裂,可見膠原纖維及組織增殖,肌絲斷裂處可見線粒體聚集,形態(tài)大小不等,嵴模糊不清,嵴間基質密度增高。7天時,與假手術組相比,心肌梗死組大鼠PGC-1α、NRF1、mtTFA蛋白表達量顯著減少,具有統(tǒng)計學意義(Pall0.05)。與心肌梗死組相比,益氣活血方組與培哚普利組PGC-1 α、NRF1、mtTFA蛋白表達呈增多(Pall0.05),差異具有統(tǒng)計學意義。28天時,與假手術組相比,心肌梗死組大鼠PGC-1α蛋白表達呈下降趨勢(P=0.111),NRF1、mtTFA表達量顯著減少,具有統(tǒng)計學意義(Pall0.01)。與心肌梗死組相比,益氣活血方組與培哚普利組PGC-1α、NRF1、mtTFA蛋白表達呈增多,差異具有統(tǒng)計學意義(Pall0.05)。表明心肌梗死后,線粒體結構破壞,線粒體生物合成功能下降,益氣活血方可以改善線粒體結構,并通過AMPK信號通路促進了心肌線粒體的生物合成。結論:1.益氣活血方可有效改善心肌梗死大鼠心臟收縮功能,減輕心室重塑程度;2.益氣活血方能夠調節(jié)心肌梗死后糖脂代謝,改善心肌細胞線粒體能量代謝障礙,其作用可能與提高Notch信號通路與AMPK信號通路交叉對話的調控有關;3.益氣活血方可以保護線粒體結構和功能,促進ATP合成,發(fā)揮心肌保護作用。
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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