本文關(guān)鍵詞：中藥酮類活性成分提取和分析的色譜聯(lián)用技術(shù)研究

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【摘要】：中藥是中華民族的傳統(tǒng)瑰寶,是有獨(dú)特優(yōu)勢并能形成我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)成果的研究領(lǐng)域。其中酮類成分,如黃酮、呋喃酮類,是中藥中一類主要的活性成分,尤其是黃酮類成分,在中藥中分布廣、種類多,具有多種藥理作用的活性成分。色譜技術(shù)作為現(xiàn)代分析技術(shù)的重要組成部分,是中藥成分定性、定量分析不可或缺的有效手段,但由于中藥的成分組成復(fù)雜、不穩(wěn)定,不同成分的含量差異大,分析存在諸多的挑戰(zhàn)。因此,開展高靈敏度、高效率的聯(lián)用色譜分析方法研究,應(yīng)用于中藥活性成分的分析,具有深遠(yuǎn)的意義及廣闊的應(yīng)用前景。本工作在成分活性評價(jià)基礎(chǔ)上,高效分離藥材桑黃中2種單體作為指標(biāo)成分,采用高速逆流色譜技術(shù)分離桑黃中的單體成分,進(jìn)一步采用超高壓液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),建立了桑黃的含量測定方法；設(shè)計(jì)功能化的移液槍頭,采用功能化槍頭固相萃取-高效液相色譜聯(lián)用技術(shù),建立多種生物樣本中4種淫羊藿黃酮苷的定量分析方法,研究內(nèi)容包括以下六章。第一章：綜述了黃酮類成分的藥效活性及在中藥中的分布情況,分析方法。從生物活性角度總結(jié)含黃酮類成分中藥的藥用價(jià)值；從分析方法、樣品前處理及體內(nèi)藥物分析三個(gè)方面系統(tǒng)介紹了色譜法在含黃酮類中藥分析中的應(yīng)用。第二章：化學(xué)法評價(jià)中藥桑黃的體外抗氧化活性,結(jié)果表明：桑黃具有羥自由基清除能力、超氧自由基陰離子清除能力及還原能力等抗氧化作用,經(jīng)超高壓液相-高分辨質(zhì)譜鑒定了桑黃醇提液中包括呋喃酮類成分Inoscavin A和多酚類成分Hypholomine B等20種成分,且其中Hypholomine B為大鼠口服后入血成分。采用整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn),評價(jià)中藥淫羊藿對慢性骨髓炎動(dòng)物的治療作用,結(jié)果表明：由4種黃酮苷組成的淫羊藿總黃酮,以每天242.70 mg kg-1的劑量灌胃給藥,治療8周后,治療組兔的骨愈合明顯改善,與模型組與萬古霉素治療組相比,具有顯著性差異。因此,有必要建立上述成分的體內(nèi)、外含量測定方法。第三章：由于桑黃中的指標(biāo)成分尚無商品化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),因而首先建立高速逆流色譜法,高效分離桑黃中Inoscavin A和Hypholomine B等單體,經(jīng)結(jié)構(gòu)表征和純度檢測后,作為含量測定的標(biāo)準(zhǔn)品；進(jìn)一步建立了超高壓液相色譜-光電二極管陣列-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用法,快速同時(shí)測定桑黃藥材中2種成分的含量,建立的方法成功應(yīng)用于桑黃不同產(chǎn)地實(shí)際樣品的檢測。與傳統(tǒng)的高效液相色譜法相比,該方法的檢測時(shí)間從50 min縮短至10 min內(nèi)。本方法Inoscavin A和Hypholomine B的定量限分別是0.39 mg L-1和0.28 mg L-1,InoscavinA和Hypholomine B的回收率分別在103.8～105.3%和104.4～105.0%范圍內(nèi),RSD值均小于3%。第四章：針對淫羊藿中4種黃酮苷成分體內(nèi)藥物濃度較低,樣品前處理技術(shù)要求高的現(xiàn)實(shí)問題,設(shè)計(jì)了具備固相萃取功能的移液槍頭,通過固相萃取填料的比較,選擇能夠高效吸附目標(biāo)成分、有效除雜的C18填料,制備了填充固相萃取填料的功能化移液槍頭。進(jìn)而對含藥血清進(jìn)行固相萃取條件考察,優(yōu)化血清固相萃取流程,確定100μL為血清取樣量,靜置吸附時(shí)間1 min,以500μL水洗除雜,100μL乙腈靜置5 min后洗脫,作為供試品溶液的最佳條件,吸取20μL進(jìn)行液相分析。與傳統(tǒng)的蛋白沉淀、溶劑萃取和市售固相萃取小柱預(yù)處理方法比較,該方法具有簡化操作步驟、減少轉(zhuǎn)移濃縮及復(fù)溶過程中的誤差、提高富集效率等優(yōu)點(diǎn),能夠有效富集生物樣本中的微量黃酮苷。同時(shí)該槍頭可以通過更換吸附填料,優(yōu)化萃取流程,推廣應(yīng)用于其他多種中藥活性成分的生物樣本預(yù)處理。第五章：采用功能化槍頭固相萃取-高效液相色譜法,建立了同時(shí)測定血清中4種黃酮苷含量的方法。結(jié)果表明4種淫羊藿黃酮苷與血清中的其他成分能很好分離；朝藿定A、B、C和淫羊藿苷均在0.05～10.00 mg·L-1內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系,平均回收率分別為98.82%、97.12%、97.43%和96.59%,檢測限分別為0.042、0.045、0.040和0.023 mg·L-1。利用建立的方法,明確了4種黃酮苷在慢性骨髓炎兔體內(nèi)的藥物濃度變化,以及在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。該方法具有靈敏度高、操作簡便等優(yōu)點(diǎn),可以用于中藥藥代動(dòng)力學(xué)研究及體內(nèi)藥物濃度監(jiān)測。第六章：對色譜及色譜聯(lián)用方法在中藥研究的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)和展望,設(shè)計(jì)便捷高效的生物樣品預(yù)處理方法,開發(fā)靈敏度高、準(zhǔn)確、快速的分析方法,十分必要,在中藥研究領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R284.1;O657.63

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