本文關(guān)鍵詞：B-Myb對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其分子機(jī)制研究

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【摘要】：B-Myb是轉(zhuǎn)錄因子Myb基因家族的成員之一,位于染色體20q13,廣泛分布于具有增殖能力的細(xì)胞中。通過(guò)對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),B-Myb在細(xì)胞周期的S-期表達(dá)量最高,而且B-Myb表達(dá)量的改變影響細(xì)胞周期的進(jìn)程、凋亡、致癌作用及衰老。基因表達(dá)譜分析顯示B-Myb在人的多種類型的惡性腫瘤中表達(dá)顯著高于相同組織來(lái)源的正常組織。促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的克隆形成、細(xì)胞周期進(jìn)程及遷移侵襲,促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖及G1-S和G2-M期的轉(zhuǎn)換等。這些研究表明B-Myb能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前,B-Myb在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機(jī)制仍不清楚,故本論文主要研究B-Myb在結(jié)腸癌樣本中的表達(dá)水平及對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、侵襲遷移、細(xì)胞凋亡及腫瘤形成等方面的影響及其分子機(jī)制。第一部分B-Myb在結(jié)腸癌樣本中的表達(dá)分析目的:檢測(cè)結(jié)腸癌組織和結(jié)腸正常組織及結(jié)腸癌不同細(xì)胞系中B-Myb表達(dá)水平,確認(rèn)B-Myb與結(jié)腸癌臨床病理特征是否具有關(guān)聯(lián)。方法:應(yīng)用qRT-PCR、Western blot及免疫組化技術(shù)檢測(cè)結(jié)腸癌組織和結(jié)腸正常組織以及結(jié)腸癌不同細(xì)胞系中B-Myb的mRNA和蛋白表達(dá)水平,統(tǒng)計(jì)分析B-Myb與病人的臨床病理分級(jí)、病理分期、腫瘤大小和淋巴道轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。結(jié)果:檢測(cè)49例結(jié)腸cDNA芯片、結(jié)腸癌細(xì)胞系及120例結(jié)腸組織芯片中B-Myb的mRNA和蛋白表達(dá)水平。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示:結(jié)腸癌組織中B-Myb的mRNA表達(dá)水平顯著高于結(jié)腸正常組織中的表達(dá)(p=0.002),其表達(dá)量與臨床病理分期關(guān)系密切(p=0.005);進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)腸癌的6個(gè)細(xì)胞系中B-Myb的mRNA和蛋白表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)不同結(jié)腸癌細(xì)胞之間B-Myb表達(dá)量存在顯著差異,其中以SW620細(xì)胞中B-Myb表達(dá)量最高,RKO細(xì)胞中B-Myb表達(dá)量最低;通過(guò)對(duì)結(jié)腸癌患者組織芯片進(jìn)行免疫組化染色,B-Myb表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿;統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示:結(jié)腸癌組織中B-Myb的蛋白表達(dá)量顯著高于結(jié)腸正常組織中的表達(dá)(p0.05),且表達(dá)量與臨床分級(jí)(p0.05)及腫瘤的大小(p0.001)存在顯著性差異。結(jié)論:結(jié)腸癌組織中B-Myb的mRNA表達(dá)水平顯著高于結(jié)腸正常組織中的表達(dá),其表達(dá)量與臨床病理分期存在相關(guān)性;結(jié)腸癌的6個(gè)細(xì)胞系中B-Myb的mRNA和蛋白表達(dá)水平存在顯著差異,其中以SW620細(xì)胞中B-Myb表達(dá)量最高,RKO細(xì)胞中B-Myb表達(dá)量最低;結(jié)腸癌患者B-Myb蛋白表達(dá)水平顯著高于結(jié)腸正常組織中的表達(dá),其表達(dá)量與臨床分級(jí)及腫瘤的大小存在相關(guān)性。第二部分B-Myb在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用目的:明確過(guò)表達(dá)或敲降B-Myb對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、HT29、SW620增殖、周期、凋亡、克隆形成及侵襲遷移的影響;檢測(cè)過(guò)表達(dá)或敲降B-Myb對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116在裸鼠體內(nèi)成瘤的影響。方法:qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)B-Myb在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、HT29、SW620中表達(dá)情況。過(guò)表達(dá)或敲降B-Myb后,流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡,免疫熒光技術(shù)檢測(cè)DNA合成(S期)及有絲分裂(M期)的變化,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的側(cè)向遷移能力,transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移侵襲能力,平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成能力,裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤能力。結(jié)果:qRT-PCR和Western blot結(jié)果提示,慢病毒感染的過(guò)表達(dá)和敲降B-Myb以及si RNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株構(gòu)建成功。CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:從72 h到96 h,B-Myb穩(wěn)定過(guò)表達(dá)HCT116和HT29細(xì)胞株的增殖能力均明顯高于對(duì)照組(P0.001);從48 h到96 h,瞬時(shí)敲降B-Myb的HCT116、HT29及SW620細(xì)胞株的增殖能力顯著低于對(duì)照組(P0.01,P0.01,P0.05);從72 h到96 h,穩(wěn)定敲降B-Myb的HCT116和HT29細(xì)胞株的增殖能力均顯著低于對(duì)照組(P0.01)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:HCT116和HT29細(xì)胞B-Myb過(guò)表達(dá)組的G1期細(xì)胞數(shù)量均較對(duì)照組減少(p0.05),而S期細(xì)胞數(shù)均較對(duì)照組增加(p0.01),G2/M期細(xì)胞數(shù)均較對(duì)照組增加(p0.05);HCT116和SW620細(xì)胞B-Myb被小干擾RNA敲降后,S期細(xì)胞數(shù)量均較對(duì)照組明顯減少(p0.05),G2/M期細(xì)胞數(shù)均較對(duì)照組明顯增加(p0.001,p0.01);HCT116和HT29細(xì)胞B-Myb穩(wěn)定敲降后,B-Myb穩(wěn)定敲降組的G1期細(xì)胞數(shù)量均較對(duì)照組顯著減少(p0.05,p0.001),HCT116的S期細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組顯著減少(p0.05),兩個(gè)細(xì)胞系中G2/M期細(xì)胞數(shù)量均較對(duì)照組顯著增加(p0.001,p0.01)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:HCT116和HT29細(xì)胞B-Myb過(guò)表達(dá)組處于S期的細(xì)胞數(shù)量均顯著高于對(duì)照組(p0.01,P0.001),處于M期的細(xì)胞數(shù)量也均顯著高于對(duì)照組(p0.01,P0.001);穩(wěn)定敲降B-Myb的HCT116細(xì)胞中,B-Myb敲降組處于S期的細(xì)胞數(shù)量顯著低于對(duì)照組(p0.001),而在穩(wěn)定敲降B-Myb的HT29細(xì)胞中,B-Myb敲降組處于S期的細(xì)胞數(shù)量高于對(duì)照組(p0.05),兩個(gè)細(xì)胞系中,B-Myb敲降組處于M期的細(xì)胞數(shù)量均高于對(duì)照組(p0.01,p0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示:HCT116和HT29細(xì)胞B-Myb過(guò)表達(dá)組細(xì)胞凋亡率均顯著低于對(duì)照組細(xì)胞凋亡率;穩(wěn)定敲降B-Myb的HCT116和HT29細(xì)胞組中細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組細(xì)胞凋亡率。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:HCT116和HT29細(xì)胞中B-Myb過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的側(cè)向遷移能力均較對(duì)照組明顯增加。HCT116、HT29、SW620三種結(jié)腸癌細(xì)胞B-Myb瞬時(shí)敲降或穩(wěn)定敲降組細(xì)胞的側(cè)向遷移能力均較對(duì)照組下降。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:B-Myb穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的HCT116(遷移實(shí)驗(yàn),P0.001;侵襲實(shí)驗(yàn),P0.001)和HT29(遷移實(shí)驗(yàn),P0.001;侵襲實(shí)驗(yàn),P0.001)細(xì)胞穿到膜下方的數(shù)量顯著多于對(duì)照組;si RNA干擾B-Myb的HCT116和HT29細(xì)胞遷移能力均顯著低于對(duì)照組(P0.001,P0.01);B-Myb穩(wěn)定敲降的HCT116(遷移實(shí)驗(yàn),P0.001;侵襲實(shí)驗(yàn),P0.001)和HT29(遷移實(shí)驗(yàn),P0.05;侵襲實(shí)驗(yàn),P0.001)細(xì)胞穿到膜下方的數(shù)量顯著少于對(duì)照組。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:HCT116和HT29細(xì)胞B-Myb過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的克隆團(tuán)數(shù)量明顯多于對(duì)照組(P0.01,P0.05);HCT116和HT29細(xì)胞B-Myb穩(wěn)定敲降組細(xì)胞的克隆團(tuán)數(shù)量均明顯少于對(duì)照組(P0.05)。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:HCT116細(xì)胞B-Myb穩(wěn)定過(guò)表達(dá)組(n=3)腫瘤的生長(zhǎng)明顯快于對(duì)照組(n=3)(P0.05),瘤體的重量也顯著高于對(duì)照組(P0.01);HCT116細(xì)胞B-Myb穩(wěn)定敲降組(n=5)腫瘤的生長(zhǎng)明顯慢于對(duì)照組(n=5)(P0.05),瘤體重量也顯著低于對(duì)照組(P0.001)。結(jié)論:B-Myb能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、HT29和SW620的增殖、G1/S期轉(zhuǎn)換、細(xì)胞的側(cè)向及正向遷移、細(xì)胞侵襲及克隆形成,抑制細(xì)胞凋亡,且B-Myb過(guò)表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的裸鼠體內(nèi)腫瘤形成。第三部分B-Myb在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制研究目的:探究B-Myb在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制。方法:RNA-seq技術(shù)及GO數(shù)據(jù)分析、pathway數(shù)據(jù)分析篩選由B-Myb調(diào)控的下游靶基因及信號(hào)通路;qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證篩選的靶基因的mRNA表達(dá)情況;Western blot技術(shù)驗(yàn)證ERK信號(hào)通路;構(gòu)建B-Myb刪除體及點(diǎn)突變體,探究B-Myb的具體轉(zhuǎn)錄激活域。結(jié)果:穩(wěn)定過(guò)表達(dá)B-Myb和敲降B-Myb的慢病毒感染結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116的總RNA進(jìn)行RNA-seq檢測(cè),B-Myb穩(wěn)定過(guò)表達(dá)組vs對(duì)照組中表達(dá)上調(diào)的基因與B-Myb穩(wěn)定干擾組vs對(duì)照組中表達(dá)下調(diào)的基因形成交集的有1558個(gè),B-Myb穩(wěn)定過(guò)表達(dá)組vs對(duì)照組中表達(dá)下調(diào)的基因與B-Myb穩(wěn)定干擾組vs對(duì)照組中表達(dá)上調(diào)的基因形成交集的有1962個(gè),對(duì)兩組交集的全部基因進(jìn)行GO富集分析,結(jié)果顯示:由B-Myb表達(dá)變化引起的差異表達(dá)的靶基因功能主要集中于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程的調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡調(diào)控、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分化及調(diào)控細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。通過(guò)qRT-PCR技術(shù)對(duì)差異表達(dá)的靶基因E2F1、E2F2、E2F3、E2F8、ZNF473、ESCO2、KIF11、NRP1、WISP2、DLC1、KBTBD6、IGFBP3進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果與RNA-seq檢測(cè)結(jié)果相符;pathway富集分析,結(jié)果顯示:富集通路主要有MAPK信號(hào)通路、細(xì)胞因子間相互作用、癌癥信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路以及Jak-STAT信號(hào)通路,通過(guò)Western blot技術(shù)檢測(cè)證實(shí):B-Myb過(guò)表達(dá)促進(jìn)ERK及AKT的磷酸化,敲降B-Myb抑制ERK及AKT磷酸化;成功構(gòu)建B-Myb刪除體:B-Myb(aa 1-359)、B-Myb(aa 1-561)、B-Myb(aa 360-700),突變體:B-Myb(N174A)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染于穩(wěn)定敲降B-Myb的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116后,通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)刪除體及突變體對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移能力的影響,結(jié)果證實(shí),B-Myb(aa 1-359)對(duì)穩(wěn)定敲降B-Myb的HCT116細(xì)胞的側(cè)向遷移能力沒(méi)有明顯影響,而B(niǎo)-Myb(aa1-561)、B-Myb(aa 360-700)及B-Myb(N174A)能夠促進(jìn)穩(wěn)定敲降B-Myb的HCT116細(xì)胞側(cè)向遷移能力。結(jié)論:B-Myb通過(guò)調(diào)節(jié)下游靶基因正向調(diào)節(jié)ERK及AKT信號(hào)通路在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中發(fā)揮作用;B-Myb基因在結(jié)腸癌胞HCT116發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所發(fā)揮的作用或許主要依賴于CR(aa 369-614)功能區(qū)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.35

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8 宋e，

本文編號(hào)：1284346