本文關鍵詞：低氧通過抑制miR-218激活PERK在低氧性肺動脈高壓中作用研究

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【摘要】：肺動脈高壓(PH)是一種涉及多種臨床狀況并會使大多數(shù)心血管及呼吸系統(tǒng)疾病復雜化的病理生理紊亂。有報導顯示PH患病率為97/百萬人,年齡標準化的死亡率為4.5-12.3/十萬人。低氧性肺動脈高壓(HPH)是由肺部疾病和(或)低氧所致的肺動脈高壓,常見于間質性肺疾病及慢性阻塞性肺病,肺部疾病發(fā)展致PH時均伴有運動能力的惡化,低氧加重和生存時間縮短。因此,對其發(fā)病機制進行研究有重要意義。MicroRNA是一種長度約22nt的小分子非編碼RNA,研究顯示與肺動脈高壓相關的因素如低氧、炎癥等均可以調節(jié)microRNA的表達。近年來,microRNA作為一種上游信號分子在PH肺血管重塑中的作用受到關注,而且越來越多的研究表明,microRNA有望作為PH治療的新靶點。本課題組通過芯片技術在HPH大鼠肺組織中發(fā)現(xiàn)了一批表達變化的microRNA,從中挑選出了表達降低的miR-218。在大鼠肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)中研究其對PASMCs增殖、遷移、凋亡的影響,并對其進行靶基因預測和驗證。在HPH大鼠模型中特異性抑制miR-218靶基因PERK,檢測抑制PERK對HPH肺動脈壓力及肺血管重塑的影響。本研究為HPH的發(fā)病機制提供了新的思路,為HPH的治療提供了新的靶點。第一部分MicroRNA在低氧性肺動脈高壓大鼠模型肺組織表達譜分析目的:檢測HPH與常氧對照組大鼠肺組織中差異性表達的microRNA。方法:首先構建HPH大鼠模型,通過右心室壓力測定(RVSP)、右心肥厚指數(shù)(RVHI)計算及HE染色確定HPH模型構建是否成功。采用microRNA芯片技術檢測HPH與常氧對照組大鼠肺組織中microRNA的表達譜,通過real-timePCR對芯片結果進行驗證,最后運用生物信息學方法對芯片結果進行分析,以篩選可能與HPH相關的 microRNA。結果:1.芯片雜交結果經分析后顯示,有51種microRNA在HPH模型大鼠肺組織中異常表達,其中表達上調的有26個(p0.001),表達下調的25個(p0.001)。選取 5 個 microRNA:miR-218,miR-26a,miR-34a,miR-98,miR-203 進行 real-time PCR驗證,結果示real-time PCR中microRNA的變化方向及程度與芯片高度一致;2.GO分析顯示,HPH大鼠肺組織與對照組差異性表達microRNA的高富集度的靶基因功能包括多種,涉及細胞的生長、分化、凋亡等。其中上調microRNA的高富集度靶基因功能包括鈣離子感受、DNA結合、細胞器成分等,下調microRNA的高富集度靶基因功能包括細胞增殖、細胞信號傳導、磷酸酶活性調節(jié)等。小結:與對照組相比,HPH大鼠肺組織中有26個microRNA表達上調,25個microRNA表達下調,通過GO分析HPH大鼠肺組織與常氧對照組差異性表達的microRNA的高富集度靶基因功能涉及細胞的生長、分化、凋亡。第二部分MiR-218在低氧處理的大鼠PASMC s中的表達及其對PASMCs增殖、遷移及凋亡的影響研究目的:檢測miR-218在低氧處理的大鼠PASMCs中的表達及其對PASMCs增殖、遷移及凋亡的影響。方法:首先用酶聯(lián)合消化法原代培養(yǎng)大鼠PASMCs并鑒定,用real-time PCR檢測低氧處理的PASMCs中miR-218的表達。在PASMCs中通過轉染miR-218-Mimic和miR-218-Inhibitor分別過表達和抑制miR-218,轉染miR-NC作為陰性對照,分別利用CCK-8和EdU法、劃痕實驗、流式法檢測其對PASMCs增殖、遷移、凋亡的影響。結果:1.低氧24h及48h后,PASMCs中miR-218的表達均顯著低于常氧對照組(P0.01);2.相比轉染miR-NC組,CCK-8實驗結果示:轉染miR-218-Mimic組OD值顯著降低,轉染miR-218-Inhibitor組OD值顯著升高(P0.05);EdU實驗結果示:轉染miR-218-Mimic組增殖期細胞比例明顯降低,而轉染miR-218-Inhibitor組增殖期細胞比例明顯增高(P0.05);劃痕實驗結果示:轉染miR-218-Mimic組轉染24h后劃痕寬度明顯大于轉染miR-NC組,轉染miR-218-Inhibitor組24h后劃痕寬度明顯小于轉染miR-NC組(P0.05);流式細胞儀檢測三組間凋亡細胞比例,結果示:3組間細胞凋亡比例無統(tǒng)計學差異(P0.05)。小結:MiR-218在低氧處理的PASMCs中表達降低,miR-218可以抑制PASMCs的增殖、遷移而不影響其凋亡。第三部分MiR-218通過抑制PERK在低氧性肺動脈高壓中作用研究目的:預測miR-218靶基因并進行驗證。方法:利用生物信息學網站預測miR-218可能的靶基因,在PASMCs中轉染miR-218-Mimic,轉染miR-NC作為對照,通過熒光定量PCR檢測miR-218可能的靶基因表達量進行初步篩選;在HPH大鼠肺組織中利用Western Blot檢測miR-218可能的靶基因PERK的表達;構建pgl-promoter+PERK 3'UTR質粒,與miR-218-Mimic、Renilla質粒共同轉染入293細胞中,共同轉染miR-NC作為對照,利用雙熒光素酶報告基因檢測轉染miR-218-Mimic后熒光素酶活性;在PASMCs中轉染miR-218-Mimic,轉染miR-NC作為對照,利用Western Blot檢測PERK的表達。結果:1.生物信息學網站預測結合文獻篩選miR-218可能的靶基因為PERK、APAK12、TRPC1,熒光定量 PCR 結果示 PERK 在轉染 miR-218-Mimic 的 PASMCs中表達降低;2.Westem Blot結果示PERK在HPH大鼠肺組織中表達增高;3.轉染miR-218-Mimic組的熒光素酶活性明顯低于轉染miR-NC組,(P0.01)。Western Blot結果示轉染miR-218-Mimic的PASMCs中PERK表達明顯低于轉染miR-NC 組。小結:低氧通過抑制miR-218而激活PERK參與HPH的發(fā)生。第四部分特異性抑制miR_218靶基因PERK對HPH大鼠模型的作用研究目的:檢測miR-218靶基因PERK的特異性抑制劑GSK2656157對HPH大鼠模型的作用。方法:將18只SD大鼠隨機分為常氧對照組(N-control)、低氧對照組(H-control)、低氧干預組(H+PERK Inhibitor),三組大鼠分別經過常氧飼養(yǎng)21天、低氧飼養(yǎng)21天、低氧飼養(yǎng)21天+ 口服PERK抑制劑GSK2656157bid21天后,經頸外靜脈插管測RVSP,留取心臟組織計算RVHI,肺組織經福爾馬林固定后,常規(guī)石蠟包埋,HE染色、EVG染色、α-SMA免疫組化,顯微鏡下觀察肺血管重塑情況,計算肺血管重塑指標WT%及肌型動脈百分比。結果:1.H-control 組 RVSP 明顯高于 N-control 組(38.56±2.67 VS 26.20±1.85,P0.05),H+PERK Inhibitor 組 RVSP 明顯低于 H-control 組(38.56±2.67 VS 31.05±2.05,P0.05)。H-control 組 RVHI 明顯高于 N-control 組(0.26±0.02 VS 0.4±0.02,P0.05),H+PERK Inhibitor 組 RVHI 明顯低于 H-control 組(0.4±0.02 VS 0.31 ±0.02,P0.05);2.HE染色,與N-control組相比,H-control組肺小血管中膜平滑肌層明顯增厚,管腔狹窄,管周炎細胞浸潤,H+PERK Inhibitor組肺小血管中膜平滑肌層增厚不明顯。EVG染色,N-control組肺肌型小動脈具有內外雙層彈力纖維及薄的肌肉層,H-control肺肌型動脈中膜平滑肌層顯著增厚,且外層彈力纖維結構顯示不清,H+PERK Inhibitor組肺肌型動脈厚度較H-control組明顯回落,外層彈力纖維結構可見。α-SMA免疫組化,肺肌型動脈中膜平滑肌被染成棕黃色,與N-control組相比,H-control組肺小動脈中膜厚度明顯增加,H+PERK Inhibitor組肺小動脈中膜厚度較H-control組明顯回落;3.H-control 組 WT%明顯高于 N-control 組(49.53±5.54%VS 20.08±3.24%,P0.01),H+PERK Inhibitor 組 WT%明顯低于 H-control 組(32.47±4.05%VS 49.53±5.54%,P0.05);H-control組肌型小動脈百分比明顯高于N-control組(58.09±6.24%VS 37.76±4.55%,P0.01),H+PERK Inhibitor 組肌型小動脈百分比明顯低于 H-control 組(58.09±6.24%VS 47.57±5.22%,P0.05)小結:特異性抑制miR-218靶基因PERK可以有效降低低氧引起的肺動脈壓力增高,改善肺血管重塑。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R544.1

【參考文獻】

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1 錢國清;王良興;陳嬋;黃曉穎;葉舒婷;;大鼠細小肺動脈平滑肌細胞原代培養(yǎng)和鑒定方法的研究[J];中國應用生理學雜志;2010年01期

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本文編號：1283204