本文關鍵詞：23kD肝再生增強因子對人腎小管上皮細胞自噬水平的調節(jié)作用

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【摘要】：第一部分構建穩(wěn)定下調23k D肝再生增強因子表達的人腎小管上皮細胞株目的:通過慢病毒感染人腎小管上皮細胞(HK-2)及嘌呤篩選的方法,構建穩(wěn)定下調23k D肝再生增強因子(augmenter of liver regeneration,ALR)表達的人腎小管上皮細胞株。方法:設計針對人ALR基因的si RNA干擾靶點序列,構建特異性干擾人ALR表達的慢病毒sh RNA/ALR,轉染人腎小管上皮細胞(HK-2)細胞。慢病毒sh RNA/control轉染HK-2細胞作為對照。通過不同濃度嘌呤霉素對HK-2細胞進行處理,確定嘌呤霉素的篩選濃度。通過實時熒光定量PCR及免疫印跡法檢測人腎小管上皮細胞中23k D ALR的表達情況。MTS檢測HK-2細胞的增殖能力。結果:序列對比確認慢病毒中ALR si RNA寡核苷酸序列插入正確,嘌呤篩選濃度確認為3μg/ml。實時熒光定量PCR及免疫印跡檢測顯示,與正常組及sh RNA/control對照組比較,sh RNA/ALR組細胞內源性23k D ALR m RNA水平及蛋白表達顯著減少(P0.05)。MTS結果顯示,下調23k D ALR表達對HK-2細胞的增殖無明顯影響(P0.05)。小結:成功構建了穩(wěn)定下調23k D ALR表達的HK-2細胞株。第二部分I/R處理對HK-2細胞23k D ALR表達及自噬水平的影響目的:了解體外缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)處理對HK-2細胞23k D ALR表達及自噬相關蛋白表達的影響。方法:采用無糖無血清培養(yǎng)基結合缺氧復氧的方法對HK-2細胞進行處理。通過免疫印跡法檢測HK-2細胞中23k D ALR表達變化及自噬相關蛋白LC3II及p62表達變化。免疫熒光觀察HK-2細胞中LC3熒光光點表達情況。結果:免疫印跡實驗證實I/R處理后HK-2細胞內23k D ALR表達升高,后逐漸降至正常。在I/R處理后3、6、12、24小時自噬相關蛋白LC3II表達均明顯升高,自噬底物蛋白p62表達下降,免疫熒光結果提示I/R處理后HK-2細胞中LC3熒光明顯增強。小結:在I/R過程中HK-2細胞ALR表達先升高,后恢復正常。HK-2細胞自噬水平先升高,后有所降低,但仍高于正常,體外I/R模型構建成功。第三部分下調23k D ALR表達對缺血再灌注誘導的HK-2細胞自噬水平的影響目的:探討下調23k D ALR表達對缺血再灌注誘導人腎小管上皮細胞自噬水平的影響并探討其作用機制。方法:用無糖無血清培養(yǎng)基結合缺氧復氧的方法對HK-2細胞進行處理,誘導HK-2細胞自噬。慢病毒sh RNA/ALR轉染HK-2細胞下調了細胞中23k D ALR的表達。免疫印跡法檢測ALR及自噬相關蛋白LC3II,p62,p-AMPK,AMPK,p-m TOR,m TOR,凋亡蛋白caspase-3的變化情況。激光共聚焦顯微鏡檢測HK-2細胞LC3熒光的表達。流式細胞儀檢測細胞內活性氧(reactive oxygen,ROS)水平。電鏡檢測HK-2細胞自噬小體的形成情況。流式細胞儀分析細胞凋亡水平。結果:免疫印跡法檢測及熒光顯微鏡結果顯示,與sh RNA/control對照組比較,sh RAN/ALR組細胞自噬水平在I/R后明顯增高,細胞內自噬小體增多,細胞ROS水平顯著增加。與sh RNA/control組相比,sh RNA/ALR組在缺血再灌注6小時(R6H)p-AMPK升高,p-m TOR降低。予以AMPK抑制劑Compound C對HK-2細胞進行處理后sh RNA/control組與sh RNA/ALR自噬水平下降,凋亡水平升高,在sh RNA/ALR組中更為明顯。小結:23k D ALR參與了缺血再灌注誘導的HK-2細胞自噬過程,下調HK-2細胞23k D ALR表達可以使自噬水平升高,而這一作用與23k D ALR表達下調導致ROS水平升高,從而誘導AMPK-m TOR通路激活有關。而抑制自噬則使HK-2凋亡水平增加。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R692

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