本文關(guān)鍵詞：藥物提高心肌干細(xì)胞治療急性心肌梗死療效的實驗研究

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【摘要】：目的:心肌干細(xì)胞(cardiac stem cells,CSCs)移植治療急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)的療效受到存活率低和歸巢細(xì)胞數(shù)量少的限制�；|(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)與其特異性受體趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)構(gòu)成的SDF-1/CXCR4軸在CSCs遷移的過程中發(fā)揮重要作用;而PODXL(podocalyxin-likeprotein1,podocalyxin)是CSCs細(xì)胞膜上的一個表面標(biāo)記,被證實在細(xì)胞粘附和細(xì)胞間相互作用中發(fā)揮重要作用。本研究在體外缺氧無血清條件下模擬心肌缺氧微環(huán)境,研究阿托伐他汀(atorvastatin,ATV)對小鼠CSCs的抗凋亡作用及可能發(fā)揮作用的分子機(jī)制。此外,本研究旨在探討ATV預(yù)處理能否增加CSCs表面CXCR4和PODXL的表達(dá),并提高其遷移能力及與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、穿越作用,進(jìn)而改善AMI后心功能。方法:首先,分離培養(yǎng)小鼠CSCs,在缺氧無血清條件下用ATV處理12小時,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst 33342熒光染色觀察細(xì)胞凋亡,并利用Western blot方法檢測通路蛋白AMPK、mTOR的磷酸化水平。其次,設(shè)置不同ATV濃度梯度組及時間梯度組,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測CSCs細(xì)胞表面CXCR4和PODXL的表達(dá)比例,確定ATV促進(jìn)CSCs細(xì)胞表面CXCR4和PODXL表達(dá)的最佳濃度及時間。通過加入CXCR4的中和抗體及轉(zhuǎn)染PODXL-siRNA阻斷PODXL的表達(dá)進(jìn)行機(jī)制研究,進(jìn)行細(xì)胞遷移實驗,細(xì)胞粘附實驗和跨內(nèi)皮遷移實驗評價各組CSCs細(xì)胞遷移能力,與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和穿越能力。最后,在體實驗中將320只雌性C57小鼠隨機(jī)分為sham組,AMI組,口服強(qiáng)化ATV組,移植CSCs組,移植ATV預(yù)處理的CSCs(ATV-CSCs)組,口服強(qiáng)化ATV聯(lián)合移植ATV預(yù)處理的CSCs組(ATV+ATV-CSCs組),ATV預(yù)處理的轉(zhuǎn)染si-PODXL的CSCs 組(ATV-PODXL-SiRNA-CSCs)組、ATV 預(yù)處理的轉(zhuǎn)染 si-CXCR4 的 CSCs 組(ATV-CXCR4-SiRNA-CSCs)組。采用結(jié)扎冠狀動脈前降支的方法制作急性心肌梗死模型,梗死后1周經(jīng)頸靜脈注射各組處理的CSCs(2×105細(xì)胞/只),對照組動物注射等體積PBS。在干細(xì)胞移植后3天(基線)及4周(終點(diǎn))分別行心臟超聲檢測、病理組織學(xué)及分子生物學(xué)檢測。結(jié)果:缺氧無血清條件引起明顯的細(xì)胞凋亡,ATV處理組細(xì)胞凋亡率顯著降低,且呈一定的濃度依賴性。ATV處理組AMPK磷酸化水平明顯升高,加入AMPK阻斷劑compound C可以顯著阻斷這種效應(yīng)。ATV可以劑量依賴性促進(jìn)CSCs表面CXCR4和PODXL的表達(dá),在1μM ATV處理組和預(yù)處理12小時組表達(dá)比例最高。細(xì)胞遷移實驗顯示,加入CXCR4的中和抗體后CSCs的遷移能力明顯下降,ATV促進(jìn)CSCs遷移的作用也被顯著抑制。細(xì)胞粘附實驗發(fā)現(xiàn),ATV可以提高CSCs的粘附能力,而阻斷PODXL的表達(dá),會顯著降低CSCs與細(xì)胞外基質(zhì)成分的粘附能力,同時也會明顯抵消ATV促進(jìn)CSCs細(xì)胞粘附的作用。在跨內(nèi)皮遷移實驗中,與CSCs組相比,ATV預(yù)處理CSCs組穿越內(nèi)皮細(xì)胞層的細(xì)胞數(shù)量顯著增加,而轉(zhuǎn)染PODXL-siRNA的CSCs組細(xì)胞數(shù)量則顯著減少。提示ATV促進(jìn)CSCs與內(nèi)皮細(xì)胞粘附及變形穿越內(nèi)皮層的作用至少部分是通過PODXL蛋白介導(dǎo)的。在體實驗中,口服強(qiáng)化ATV聯(lián)合ATV預(yù)處理能夠促進(jìn)CSCs的存活及歸巢,并從減輕炎癥細(xì)胞浸潤、抑制纖維化、減少心肌細(xì)胞凋亡及增加梗死周邊區(qū)血管新生等多個方面促進(jìn)心肌修復(fù),進(jìn)而減小心肌梗死面積,減輕心臟重塑,改善心功能。結(jié)論:本研究結(jié)果表明ATV具有顯著的抗凋亡作用,可明顯提高CSCs在缺氧無血清條件下的存活率,其作用可能與AMPK/mTOR通路有關(guān)。使用ATV預(yù)處理的CSCs進(jìn)行細(xì)胞移植,可以通過提高CSCs細(xì)胞表面CXCR4和PODXL蛋白的表達(dá)地促進(jìn)其歸巢,改善AMI后心功能,聯(lián)合口服強(qiáng)化ATV和ATV預(yù)處理的CSCs可以進(jìn)一步提高CSCs移植的療效,為提高干細(xì)胞移植療效提供了一種新的可能思路。目的:急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)后局部心肌微環(huán)境惡劣,導(dǎo)致心肌細(xì)胞大量丟失,我們課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),他汀可以對缺氧無血清條件下內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是調(diào)控細(xì)胞能量代謝的核心分子,它可以抑制下游哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)活性,在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和自噬中發(fā)揮重要作用。本研究擬應(yīng)用Wistar大鼠冠脈結(jié)扎制作AMI模型,給予AMPK抑制劑compound C和ATV進(jìn)行干預(yù),對比觀察他汀早期干預(yù),對梗死后心肌微環(huán)境的影響,明確ATV對梗死周邊區(qū)心肌細(xì)胞的凋亡和自噬的調(diào)節(jié)作用及相關(guān)通路。方法:將100只8周齡200-220gWistar大鼠隨機(jī)平均分為5組:sham組,AMI組,口服強(qiáng)化ATV組(ATV組),口服強(qiáng)化ATV并注射compound C組(ATV+CC組),注射compound C組(CC組)。sham組手術(shù)線穿過前降支,但不結(jié)扎;其余各組開胸行前降支結(jié)扎,其中ATV(10mg/kg/d)和compound C(20mg/kg/w)從AMI模型制備當(dāng)天開始給予至取材。為評價大鼠心功能的變化,我們在基線(AMI后3天)及終點(diǎn)(AMI后4周)時兩次進(jìn)行超聲心動圖檢查來檢測左室功能。此外,通過ELISA,病理學(xué)檢測,Western blot等檢測炎癥因子水平,細(xì)胞凋亡,細(xì)胞自噬及通路蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:超聲數(shù)據(jù)顯示,與AMI組相比,口服ATV組的左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)有明顯提高;組織病理學(xué)檢測顯示,與AMI組相比,口服ATV組的左室纖維化面積和炎性細(xì)胞浸潤明顯改善,炎癥因子表達(dá)水平降低;此外,口服ATV組凋亡細(xì)胞明顯減少,自噬陽性細(xì)胞明顯增加。加入AMPK抑制劑compound C后ATV的這些保護(hù)作用均被顯著抑制。Western blot結(jié)果顯示,口服ATV組p-AMPK的表達(dá)水平較其他幾組明顯上調(diào),而p-p53和p-mTOR的水平則明顯下調(diào)。使用AMPK抑制劑compound C后,ATV+CC組和CC組p-AMPK的表達(dá)水平均顯著低于ATV組,與此相反的是,這兩組p-p53和p-mTOR的表達(dá)水平則顯著升高。而各組總AMPK,mTOR和p53的表達(dá)量卻沒有顯著差異。由此可知,口服ATV可以促進(jìn)AMPK磷酸化,提高p-AMPK/AMPK的比例,降低p-p53/p53和p-mTOR/mTOR的比例。而加入compound C后,ATV對p53和mTOR磷酸化的調(diào)節(jié)作用也被顯著抑制。結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)在大鼠急性心梗后4周,ATV可以通過AMPK/mTOR通路顯著促進(jìn)細(xì)胞自噬,抑制細(xì)胞凋亡;并且通過激活A(yù)MPK/mTOR通路,ATV可以促進(jìn)心肌存活,減輕炎癥反應(yīng),改善心功能。目的:在缺血再灌注損傷中,心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(cardiac microvascular endothelial cells,CMECs)通過微循環(huán)控制、旁分泌及近分泌、屏障保護(hù)三大功能在局部心肌組織中發(fā)揮保護(hù)作用。同時CMECs在缺血再灌注損傷時較心肌細(xì)胞更加敏感,更易受到損傷。通心絡(luò)是一種由12種天然藥材構(gòu)成的中藥復(fù)方制劑,具有保護(hù)內(nèi)皮和防治心肌缺血再灌注損傷的功能。在本實驗中,我們通過CMECs體外缺氧/復(fù)氧損傷模型和通心絡(luò)處理,采取TMT(Tandem mass tag)標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)譜方法檢測內(nèi)皮細(xì)胞中多種蛋白的變化以及通心絡(luò)的調(diào)節(jié)作用,以便從整體水平系統(tǒng)研究缺氧/復(fù)氧損傷對于CMECs細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的影響以及通心絡(luò)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的相關(guān)機(jī)制。方法:以不同濃度的通心絡(luò)處理心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞,缺氧2小時,復(fù)氧2小時,流式細(xì)胞術(shù)分析凋亡率以確定通心絡(luò)作用的最佳濃度。通過TMT標(biāo)記的蛋白質(zhì)譜法檢測心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞內(nèi)發(fā)生變化的蛋白及通心絡(luò)處理后變化的蛋白,并通過基因本體論分析及文獻(xiàn)綜述發(fā)生變化的蛋白的功能及參與的通路。為進(jìn)一步驗證差異蛋白功能,我們選取在缺氧/復(fù)氧和通心絡(luò)干預(yù)下有顯著變化的蛋白血紅素加氧酶-1(heme oxygenase 1,HMOX1)和血管生成素-2(angiopoietin-2 isoform c precursor,ANGPT2),分別進(jìn)行抑制和過表達(dá),通過細(xì)胞遷移實驗,成管實驗,增殖實驗等進(jìn)行功能學(xué)驗證。結(jié)果:通心絡(luò)濃度依賴性地減少CMECs細(xì)胞凋亡,800μg/mL通心絡(luò)的抗凋亡作用最明顯。我們最終在三組中篩選出50個差異蛋白,并且進(jìn)一步分析了這些蛋白的功能及通路。缺氧/復(fù)氧顯著改變CMECs細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá),而通心絡(luò)的干預(yù)會進(jìn)一步改變細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)。與正常組相比,缺氧/復(fù)氧組下調(diào)了 30種蛋白的表達(dá)水平;而與缺氧/復(fù)氧組相比,通心絡(luò)干預(yù)組上調(diào)了 6種蛋白的表達(dá),下調(diào)了 5種蛋白的表達(dá)。這些差異蛋白的功能主要包括細(xì)胞增殖,應(yīng)激反應(yīng),調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)代謝等。我們選取了一些在缺氧/復(fù)氧條件下發(fā)揮重要作用的蛋白如HMOX1,ANGPT2等進(jìn)行進(jìn)一步分析。在缺氧/復(fù)氧條件下,通心絡(luò)顯著抑制CMECs細(xì)胞凋亡,促進(jìn)CMECs細(xì)胞增殖,遷移和成管。當(dāng)同時加入HMOX1抑制劑TiiPPIX或過表達(dá)ANGPT2時,細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加,發(fā)生增殖和遷移的細(xì)胞數(shù)量,成管長度及血管分支數(shù)均顯著減少。結(jié)論:TMT標(biāo)記蛋白質(zhì)譜檢測幫助我們從分子水平更深入的了解缺血再灌注損傷機(jī)制及通心絡(luò)的調(diào)節(jié)作用。我們確定了 CMECs細(xì)胞內(nèi)與缺血再灌注損傷相關(guān)的50個差異蛋白,并分析了它們可能參與的多種功能調(diào)節(jié)及通路。缺血再灌注會顯著改變CMECs細(xì)胞內(nèi)多種蛋白的表達(dá),而通心絡(luò)干預(yù)會進(jìn)一步改變這些因子的水平,提示通心絡(luò)可能通過下調(diào)炎癥因子的表達(dá),抑制氧化應(yīng)激因子,調(diào)節(jié)多種細(xì)胞內(nèi)代謝活動,發(fā)揮微血管內(nèi)皮保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R542.22
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本文編號：1271875