本文關(guān)鍵詞：TRIM31在抗病毒天然免疫中的功能及其機(jī)制研究

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【摘要】：固有免疫是機(jī)體抵抗外界病毒、細(xì)菌等微生物感染的第一道防線,病毒的核酸成分可以引起機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。固有免疫的激活需要模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors.PRRs)識(shí)別病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns,PAMPs)。細(xì)胞內(nèi)存在的多種模式識(shí)別受體可以識(shí)別病毒的核酸成分,如Toll 樣受體(Toll-like receptors.TLRs)中的 TLR3、TLR7、TLR8 和 TLR9,可以識(shí)別暴露于細(xì)胞內(nèi)體中中的病毒RN A和DN A。細(xì)胞漿中游離的RN A成分可被維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ受體(RIG-I-like receptors,RLRs)中的RIG-I或MDA5所識(shí)別。游離于細(xì)胞漿中的病毒DNA成分則可以被cGAS、IFI16、DDX41等DNA受體識(shí)別。天然免疫細(xì)胞的PRRs識(shí)別病毒的核酸成分后,引起一系列信號(hào)通路的活化,誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生,最終清除感染機(jī)體的病原微生物。線粒體抗病毒蛋白MAVS(也被稱作IPS1,VISA或Cardif)是RLRs信號(hào)通路中重要的接頭分子。研究表明,RNA病毒感染機(jī)體后可引起MAVS構(gòu)象發(fā)生變化,形成朊蛋白樣(prion-like)聚集體。MAVS朊蛋白白樣聚集體的形成對(duì)RLRs信號(hào)通路的活化起著關(guān)鍵作用,然而MAVS形成聚集體的分了機(jī)制并不清楚。MAVS在線粒體上的定位對(duì)其功能發(fā)揮起著決定性的作用,因此我們假設(shè)定位于線粒體上的蛋白可能會(huì)對(duì)MAVS的功能有一定的調(diào)控作用。TRIM31屬于E3泛素連接酶家族中的一員,在癌癥等人類疾病中發(fā)揮著重要作用,也有文章報(bào)道TRIM31可以部分定位在線粒體上,因此本論文探索了TRIM31是否通過影響MAVS功能進(jìn)而調(diào)控天然免疫抗病毒反應(yīng)。我們的研究發(fā)現(xiàn)TRIM31可以正向調(diào)控MAVS所介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的生成,TRIM31特異性敲基因小鼠更加易于感染RNA病毒。具體機(jī)制依賴于TRIM31可以對(duì)MAVS第10位、第311位及第461位的賴氨酸進(jìn)行K63位泛素化修飾,從而促進(jìn)MAVS朊蛋白樣聚集體的形成,最終促進(jìn)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。一.研究目的:探討TRIM31是否影響MAVS所介導(dǎo)的信號(hào)通路,并闡明其具體分子機(jī)制,最后通過敲基因小鼠動(dòng)物模型驗(yàn)證TRIM31影響抗病毒天然免疫的生理意義。二.研究方法:1.TRIM31在細(xì)胞內(nèi)的定位將含GFP標(biāo)簽的TRIM31過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中,培養(yǎng)24小時(shí)后,SeV感染6小時(shí)。免疫熒光技術(shù)檢測(cè)TRIM31在線粒體上的定位情況。取健康C57 BL/6小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,SeV感染不同時(shí)間點(diǎn)后,提取線粒體蛋白,Western Blotting方法檢測(cè)TRIM31在細(xì)胞漿及線粒體上的蛋白含量。2.TRIM31調(diào)控IFN-β的產(chǎn)生和抗病毒反應(yīng)2.1 TRIM31過表達(dá)對(duì)IFN-β產(chǎn)生的影響在HEK293T細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染Flag標(biāo)簽的TRIM31過表達(dá)載體,培養(yǎng)24小時(shí)后,SeV感染或轉(zhuǎn)染poly(I:C)系列時(shí)間點(diǎn),實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)IFN-β產(chǎn)生的變化。2.2 TRIM31干擾后對(duì)IFN-β產(chǎn)生的影響提取小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,轉(zhuǎn)染小干擾RNA減低TRIM31的表達(dá),SeV感染不同時(shí)間點(diǎn),實(shí)時(shí)熒光定量PCR和ELISA技術(shù)檢測(cè)IFN-β產(chǎn)生及分泌。2.3TRIM31對(duì)病毒復(fù)制的影響分別轉(zhuǎn)染TRIM31干擾RNA或者TRIM31過表達(dá)載體于HEK293T細(xì)胞中,用VSV感染不同時(shí)間點(diǎn),實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法檢測(cè)IFN-β產(chǎn)生和VSV mRNA水平的變化;利用熒光顯微鏡直接觀察病毒的復(fù)制情況;收集細(xì)胞上清,利用病毒空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度情況。3.TRIM31敲除對(duì)機(jī)體抗病毒的生理意義3.1 TRIM31敲除后對(duì)IFN-β產(chǎn)生的影響提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,分別用5'ppp-RNA、LPS、Poly(I:C)等刺激,或者 SeV、HSV-1 感染,實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)IFN-β及IFN相關(guān)基因的表達(dá)。3.2TRIM31敲除對(duì)機(jī)體中病毒復(fù)制的影響取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,用VSV或HSV-1感染不同時(shí)間點(diǎn),實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)IFN-β表達(dá)和病毒mRNA水平的變化;收集細(xì)胞上清,病毒空斑實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)病毒滴度;Western Blotting方法檢測(cè)VSV蛋白的表達(dá)變化。取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠,腹腔注射VSV或HSV-1,24小時(shí)后小鼠眼球取血的到血清,ELISA檢測(cè)血清中IFN-β分泌變化;取肝臟、脾臟、肺臟及腦組織,提取總RNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)組織中IFN-β和病毒mRNA水平的變化;提取蛋白白,Western Blotting方法檢測(cè)VSV蛋白水平的變化;組織研磨得到上清,病毒空斑實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)病毒滴度變化;免疫組化及HE染色方法觀察組織損傷情況。4.TRIM31對(duì)RLR信號(hào)通路活化的影響將TRIM31過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系24小時(shí)后,SeV或HSV-1感染不同時(shí)間點(diǎn),Western Blotting檢測(cè)TBK-1、IRF3磷酸化情況及IRF3在胞質(zhì)、胞核中的含量變化情況;非變性Western Blotting檢測(cè)IRF3二聚化情況;通過雙熒光素酶報(bào)告基因手段檢測(cè)IRF3報(bào)告基因活性的變化情況。取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,SeV或HSV-1感染不同時(shí)間點(diǎn),Western Blotting檢測(cè)TBK-1、IRF3磷酸化情況及IRF3在胞質(zhì)、胞核中的變化情況;非變性Western Blotting檢測(cè)IRF3二聚化情況。5.TRIM31靶分子的尋找將RLR信號(hào)通路中相關(guān)的接頭分子RIG-I、MDA5、MAVS、TBK1、IKKε、IRF3-5D等過表達(dá)載體與TRIM31表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系,利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR及雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)TRIM31對(duì)不同接頭蛋白所介導(dǎo)的IFN-β卩 mRNA表達(dá)及報(bào)告基因活性的影響。將相關(guān)接頭分子過表達(dá)載體與TRIM31表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRIM31與各接頭分子的結(jié)合情況。6.TRIM31與MAVS結(jié)合實(shí)驗(yàn)提取C56BL/6小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,SeV感染不同時(shí)間點(diǎn),用TRIM31特異性抗體進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),檢測(cè)內(nèi)源性TRIM31與MAVS的結(jié)合。利用體外翻譯系統(tǒng)分別得到TRIM31與MAVS的蛋白,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)體外表達(dá)的TRIM31與MAVS的結(jié)合情況。分別構(gòu)建TRIM31的截?cái)嗤蛔凅w與MAVS的截?cái)嗤蛔凅w,共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRIM31與MAVS的截?cái)嗤蛔凅w的結(jié)合情況,尋找TRIM31與MAVS發(fā)生結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。7.TRIM31對(duì)MAVS的泛素化情況將Flag標(biāo)簽的TRIM31過表達(dá)載體、Myc標(biāo)簽的目的分子過表達(dá)載體和HA標(biāo)簽的泛素過表達(dá)載體(WT、K48或K63)共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系,24小時(shí)后提取蛋白,用Myc特異性抗體進(jìn)行免疫共沉淀,Western Blotting檢測(cè)TRIM31對(duì)目的分子泛素化水平的影響及泛素化形式的影響。構(gòu)建一系列Myc標(biāo)簽的MAVS賴氨酸點(diǎn)突變過表達(dá)載體,分別與Flag標(biāo)簽的TRIM31過表達(dá)載體和HA標(biāo)簽的泛素過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系,24小時(shí)后提取蛋白,免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)TRIM31對(duì)不同賴氨酸點(diǎn)突變載體泛素化的影響,探討MAVS上被TRIM31催化形成泛素鏈的賴氨酸位點(diǎn)。提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,SeV感染不同時(shí)間點(diǎn)后,提取細(xì)胞蛋白,利用MAVS特異性抗體進(jìn)行免疫共沉淀,Western Blotting方法檢測(cè)TRIM31對(duì)MAVS內(nèi)源性泛素化水平的影響。將MAVS構(gòu)建到含有T7啟動(dòng)子的PCDNA3.1-Myc過表達(dá)載體,將TRIM31構(gòu)建到含有T7啟動(dòng)子的PCDNA3.1-Flag過表達(dá)載體上,使用Promega公司的體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)(TNT Quick Coupled Transcription/Translation System)對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄翻譯,將翻譯的蛋白,加入BostonBiochem公司生產(chǎn)的體外泛素修飾系統(tǒng)(包含El,UbcH5a,K48.K63,K48R或者K63R等蛋白),室溫反應(yīng),使用Myc標(biāo)簽抗體進(jìn)行免疫共沉淀,檢測(cè)TR1M31對(duì)MAVS進(jìn)行invitro泛素化的情況及泛素化形式。8.TRIM31通過E3連接酶活性影響RLR信號(hào)通路構(gòu)建TRIM31泛素連接酶功能缺失點(diǎn)突變載體,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù),Western Blotting技術(shù)檢測(cè)TRIM31泛素連接酶功能缺失后對(duì)RLR信號(hào)通路介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生的影響,對(duì)病毒復(fù)制的影響,對(duì)MAVS泛素化的影響,以及對(duì)MAVS多聚化形成的影響。9.基因恢復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)證明TRIM31通過泛素化MAVS影響RLR介導(dǎo)的信號(hào)通路提取TRIM31缺陷MEF細(xì)胞,分別轉(zhuǎn)染空對(duì)照載體、野生型TRIM31過表達(dá)載體及E3泛素連接酶功能缺失點(diǎn)突變過表達(dá)載體,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù),Western Blotting技術(shù)檢測(cè)特異性恢復(fù)TRIM31基因表達(dá)后對(duì)IFN-β產(chǎn)生的影響,對(duì)病毒復(fù)制的影響,對(duì)MAVS泛素化的影響,以及對(duì)MAVS多聚化形成的影響。10.TRIM31對(duì)MAVS形成朊蛋白樣多聚體的影響轉(zhuǎn)染TRIM31過表達(dá)載體于HEK293T細(xì)胞系,或者用TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,SeV感染不同時(shí)間點(diǎn)后,提取細(xì)胞線粒體,直接利用SDD-AGE方法檢測(cè)TRIM31過表達(dá)或者缺失后對(duì)MAVS朊蛋白樣多聚體形成的影響;或者將提取的SeV預(yù)刺激的線粒體進(jìn)行體外泛素化修飾,反應(yīng)結(jié)束后,再SDD-AGE方法檢測(cè)TRIM31對(duì)MAVS體外朊蛋白樣多聚體形成的影響。三.實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.RNA病毒感染介導(dǎo)TRIM31募集到線粒體上有文獻(xiàn)報(bào)道,TRIM31分布于線粒體上及細(xì)胞漿中,為了進(jìn)一步研究RNA病毒感染是否影響TRIM31在線粒體的定位,我們將含有GFP標(biāo)簽的TRIM31過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中,培養(yǎng)24小T后,再感染SeV6小時(shí),利用線粒體標(biāo)記蛋白作為參照,免疫熒光技術(shù)觀察TRIM31在線粒體上的定位情況。我們發(fā)現(xiàn)SeV病毒感染介導(dǎo)了TRIM31向線粒體上募集。提取C57BL/6小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,SeV感染不同T間點(diǎn)后,提取線粒體蛋白,用Western Blotting方法檢測(cè)TRIM31在線粒體上的含量,我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞SeV病毒感染后,定位于線粒體上TRIM31蛋白含量明顯增加。以上結(jié)果提示我們RNA病毒感染會(huì)引起TRIM31向線粒體的募集。2.TRIM31正向調(diào)控RLR介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生進(jìn)而增強(qiáng)天然免疫抗病毒反應(yīng)2.1 TRIM31過表達(dá)促進(jìn)RNA病毒介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生為了探究TRIM31是否影響RLR信號(hào)通路,在HEK293T細(xì)胞或Hela細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Flag標(biāo)簽的TRIM31過表達(dá)載體,培養(yǎng)24小時(shí)后,SeV分別感染4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)或轉(zhuǎn)染poly(I:C)6小時(shí)、12小時(shí),實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)IFN-β mRNA水平的變化,我們發(fā)現(xiàn)TRIM31過表達(dá)后,SeV感染及poly(I:C)轉(zhuǎn)染引起的IFN-β mRNA水平明顯升高。這預(yù)示著TRIM31正向調(diào)控RLR所介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生。2.2 TRIM31干擾抑制RNA病毒介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生。為了進(jìn)一步明確TRIM31在RLR信號(hào)通路所起的作用,我們合成了 TRIM31小鼠源和人源的小干擾RNA,提取小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,用轉(zhuǎn)染小干擾的方法將降低TRIM31的表達(dá),SeV分別感染4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí),實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和ELISA技術(shù)檢測(cè)IFN-β3產(chǎn)生及分泌。結(jié)果顯示,TRIM31干擾后,SeV感染所介導(dǎo)的IFN-β的在m RNA水平及分泌水平都出現(xiàn)明顯下降,這進(jìn)一步證明了 TRIM31可以正向調(diào)控RLR所介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生。2.3 TRIM31的抗病毒作用為了研究TRIM31對(duì)機(jī)體的抗病毒作用,轉(zhuǎn)染TRIM31特異性小干擾RNA或者TRIM31過表達(dá)載體于HEK293T細(xì)胞系,掊養(yǎng)24小時(shí)候,用含有綠色熒光蛋白的VSV-GFP進(jìn)行感染,實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)IFN-β的產(chǎn)生和VSV mRNA水平的變化;利用熒光顯微鏡直接觀察病毒的復(fù)制情況;收集細(xì)胞上清,進(jìn)行病毒空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度。我們發(fā)現(xiàn)TRIM31十?dāng)_后,VSV感染引起IFN-βmRNA水平表達(dá)明顯下降,進(jìn)而使得VSV病毒逃逸并大量復(fù)制。病毒空斑實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)TRIM31干擾組中VSV病毒滴度明顯升高。相反的,過表達(dá)TRIM31之后,VSV介導(dǎo)的IFN-βmRNA水平的產(chǎn)生明顯升高,VSV病毒mRNA水平明顯下降,熒光顯微鏡觀察病毒的復(fù)制能力減弱,病毒空斑實(shí)驗(yàn)證明TRIM31過表達(dá)組的VSV病毒滴度明顯下降。由此我們可以看到TRIM31在機(jī)體抗病毒中起著十分重要的作用。3.TRIM31抗病毒的生理意義3.1 TRIM31缺陷抑制RNA病毒引起的IFN-β產(chǎn)生為了進(jìn)一步驗(yàn)證TRIM31在RLR信號(hào)通路中所起的作用及TRIM31抗病毒的生理意義,我們構(gòu)建了 TRIM31特異性敲基因小鼠,提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,分別使用LPS、Poly(I:C)等TLR通路配體刺激細(xì)胞,SeV、VSV等RLR通路配體感染細(xì)胞,HSV-1等DNA配體感染細(xì)胞,實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)IFN-β及IFN相關(guān)基因ISGs的表達(dá)差異,我們發(fā)現(xiàn)SeV感染或5'ppp-RNA轉(zhuǎn)染后,TRIM31敲基因小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞所表達(dá)的IFN-β以及IFN-β相關(guān)基因如Cc15、Cxc1 10的表達(dá)明顯下降。而使用LPS、Poly(I:C)刺激或HSV-1感染的野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞所表達(dá)的IFN-β以及IFN-β相關(guān)基因無明顯變化差異。我們分別提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞或者骨髓來源巨噬細(xì)胞,重復(fù)上面的實(shí)驗(yàn),得到相似的結(jié)論。這說明TRIM31特異性敲除可以明顯抑制RNA病毒介導(dǎo)的I型干擾素的生成,而對(duì)TLR信號(hào)通路等沒有影響。3.2 TRIM31敲基因小鼠更易于感染RNA病毒由于Ⅰ型干擾素與病毒的復(fù)制、清除有著直接關(guān)系,我們進(jìn)一步研究了 TRIM31在機(jī)體抵抗病毒復(fù)制方面的生理意義,提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,然后用VSV或HSV-1進(jìn)行感染,實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)IFN-β和VSV在mRNA水平的變化;收集細(xì)胞上清,利用病毒空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度差異。收取細(xì)胞蛋白,Western Blotting方法檢測(cè)VSV蛋白水平的表達(dá)差異。我們發(fā)現(xiàn)與野生小鼠相比較,TRIM31敲基因小鼠被VSV感染后產(chǎn)生IFN-β在mRNA水平明顯下降,而VSV在mRNA水平則明顯升高;病毒空斑實(shí)驗(yàn)顯示TRIM31敲基因小鼠VSV病毒滴度明顯升高。我們通過腹腔注射VSV病毒的方法建立小鼠的RNA病毒感染模型,觀察小鼠的死亡率,繪制小鼠生存曲線,發(fā)現(xiàn)TRIM31敲基因小鼠在病毒感染后的死亡率史高;小鼠眼球取血得到血清,ELISA方法檢測(cè)TRIM31敲基因小鼠感染后血清中IFN-β的產(chǎn)量明顯低于野生型小鼠;處死小鼠后取肝臟、脾臟和肺臟,提取組織總RNA和蛋白,實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)到TRIM31敲基因小鼠感染后的肝臟、脾臟和肺臟中IFN-β3的表達(dá)明顯低于野生型小鼠,而VSV的mRNA則明顯高于野生型小鼠;Western Blotting方法檢測(cè)同樣發(fā)現(xiàn)TRIM31敲基因小鼠感染后各組織中VsV蛋白含量也是明顯高于野生型小鼠;肝臟、脾臟和肺臟等組織研磨得到上清,病毒空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度,發(fā)現(xiàn)TRIM31敲基因小鼠感染后的病毒滴度明顯高于野生型小鼠;取小鼠肺臟組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)及HE染色,觀察肺損傷情況,發(fā)現(xiàn)TRIM31敲基因小鼠病毒感染后肺損傷比野生型小鼠更加嚴(yán)重。以上結(jié)果說明相比于野生型小鼠,TRIM31敲基因小鼠更容易感染RNA病毒。我們通過腹腔注射HSV-1病毒的方法建立小鼠的DNA病毒感染模型重復(fù)以上實(shí)驗(yàn),則發(fā)現(xiàn),野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠在抵抗DNA病毒的過程中沒有明顯的差異。4.TRIM31對(duì)RLR信號(hào)通路活化的影響RLR信號(hào)通路活化后可以引起TBK1的自身磷酸化及激酶活性的激活,進(jìn)而引起IRF3的磷酸化,磷酸化后的IRF3發(fā)生二聚化并入核,結(jié)合到IFN的啟動(dòng)子區(qū)域,引起IFN-β的產(chǎn)生。因此,TBK1的磷酸化及IRF3的磷酸化、二聚化、入核代表RLR信號(hào)通路的活化。我們轉(zhuǎn)染TRIM31過表達(dá)載體于HEK293T細(xì)胞系,分別用SeV感染4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí),Western Blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRIM31過表達(dá)后病毒介導(dǎo)的TBK-1和IRF3磷酸化明顯增強(qiáng),IRF3進(jìn)入細(xì)胞核中的含量也明顯增加,利用非變性Western Blotting發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TRIM31可以促進(jìn)病毒介導(dǎo)的IRF3二聚體的形成。利用雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)IRF3活性的變化,將IRF3的報(bào)告基因與TRIM31過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T,SeV感染后,我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TRIM31明顯促進(jìn)病毒介導(dǎo)的IRF3的報(bào)告基因的活性。利用DNA病毒HSV-1感染細(xì)胞,利用以上手段發(fā)現(xiàn)TRIM31過表達(dá)并未影響DNA病毒介導(dǎo)的TBK1、IRF3的磷酸化。提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,分別用SeV感染細(xì)胞,Western Blotting檢測(cè)手段發(fā)觀TRIM31敲除后SeV介導(dǎo)的TBK-1和IRF3磷酸化明顯減弱,IRF3進(jìn)入細(xì)胞核中的含量也明顯減少,利用非變性Western Blotting發(fā)現(xiàn)TRIM31敲除可以抑制IRF3 一聚體的形成。利用DNA病毒HSV-1感染細(xì)胞,重復(fù)上述實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)HSV-1介導(dǎo)的TBK1及IRF3的活化并未受到影響。以上結(jié)果從多個(gè)層次說明TRIM31特異性促進(jìn)RLR信號(hào)通路的活化,而對(duì)DNA病毒介導(dǎo)的信號(hào)通路活化沒有影響。5.TRIM31靶分子的尋找前面結(jié)果表明TRIM31促進(jìn)RNA病毒引起的IFN-β的產(chǎn)生,對(duì)病毒的復(fù)制起著明顯的抑制作用。那么TRIM31是如何影響RLR所介導(dǎo)的信號(hào)通路的,具體的作用靶點(diǎn)是什么。接下來,我們將RLR信號(hào)通路中相關(guān)的接頭分子RIG-I、MDA5、MAVS、TBK1、IKKε、1RF3-5D等接頭蛋白的過表達(dá)載體與TRIM31表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)TRIM31對(duì)不同接頭蛋白所介導(dǎo)的IFN-β m RNA產(chǎn)生及報(bào)告基因活性的影響,我們發(fā)現(xiàn)TRIM31過表達(dá)明顯可以促進(jìn)RIG-I、MDA5、MAVS接頭蛋白所介導(dǎo)的IFN-β3 mRNA的產(chǎn)生以及IFN-β報(bào)告基因活性,而對(duì)接頭TBK1、IKKε、IRF3-5D介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生沒有影響。結(jié)合之前我們發(fā)現(xiàn)TRIM31在RNA病毒感染后可以募集到線粒體上的現(xiàn)象,提示我們TRIM31作用靶點(diǎn)有可能是MAVS。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一假設(shè),我們將RIG-I、MDA5、MAVS、TBK1、IKKε、IRF3-5D等接頭蛋白的過表達(dá)載體與TRIM31過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRIM31與各接頭分子的結(jié)合情況,結(jié)果顯示TRIM31與MAVS有明顯結(jié)合作用,而與其他接頭分子沒有結(jié)合作用。因此我們得出結(jié)論TRIM31 可能通過靶向MAVS進(jìn)而調(diào)控RLR所介導(dǎo)的信號(hào)通路。6.TRIM31的coiled-coil結(jié)構(gòu)域與MAVS的proline-rich結(jié)構(gòu)域相結(jié)合為了更加細(xì)致深入的研究TRIM31與MAVS的結(jié)合情況,我們進(jìn)一步檢測(cè)了它們內(nèi)源性的結(jié)合情況,提取小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,SeV感染不同時(shí)間點(diǎn),用內(nèi)源性TRIM31抗體進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),檢測(cè)內(nèi)源性TRIM31與MAVS的結(jié)合,我們觀察到隨著病毒感染時(shí)間的增加,TRIM31與MAVS結(jié)合也逐漸增強(qiáng),兩者的結(jié)合存在時(shí)間依賴性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證兩者是否是直接性結(jié)合,我們利用體外翻譯系統(tǒng),過表達(dá)TRIM31與MAVS的蛋白,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)外源性表達(dá)TRIM31 與 MAVS發(fā)生了直接結(jié)合。為了探究TRIM31與MAVS發(fā)生結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)域,我們構(gòu)建了一系列TRIM31 與 MAVS的截?cái)嗤蛔凅w,將各截?cái)囿w共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRIM31與MAVS的截?cái)嗤蛔凅w的結(jié)合情況,實(shí)驗(yàn)表明TRIM31的coiled-coil結(jié)構(gòu)域與MAVS的proline-rich結(jié)構(gòu)域在TRIM31與MAVS的結(jié)合過程中起著重要的作用。7.TRIM31對(duì)MAVS的泛素化實(shí)驗(yàn)TRIM31屬于TRIM家族,是E3泛素連接酶的一種,因此我們想進(jìn)一步明確TRIM31對(duì)MAVS是否進(jìn)行了泛素化修飾。我們將Flag標(biāo)簽的TRIM31過表達(dá)載體,Myc標(biāo)簽MAVS過表達(dá)載體和HA標(biāo)簽的泛素表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系,培養(yǎng)24小時(shí)后提取蛋白,用Myc特異性抗體進(jìn)行免疫共沉淀,Western Blotting結(jié)果顯示TRIM31 可以促進(jìn)MAVS的K63位泛素化修飾。MAVS分子上共有14個(gè)賴氨酸位點(diǎn),為了詳細(xì)闡明TRIM31對(duì)其中哪個(gè)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行了泛素化修飾,我們構(gòu)建了 一系列MAVS賴氨酸點(diǎn)突變過表達(dá)載體,與TRIM31過表達(dá)載體及泛素過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系,免疫共沉淀技術(shù)及Western Blotting技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)TRIM31主要將MAVS上的第10位,第311位,第461位賴氨酸進(jìn)行K63位泛素化修飾。提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,SeV感染不同時(shí)間點(diǎn),提取細(xì)胞蛋白,利用MAVS內(nèi)源性抗體進(jìn)行免疫共沉淀,Western Blotting技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRIM31敲除后SeV介導(dǎo)的MAVS內(nèi)源性K63位泛素化水平明顯下降,而TRIM31對(duì)MAVS的K48位泛素化修飾無明顯影響。我們進(jìn)一步通過體外蛋白翻譯系統(tǒng)和體外泛素化系統(tǒng),檢測(cè)TRIM31對(duì)MVAS的體外泛素化修飾情況,結(jié)果表明TRIM31可以在體外系統(tǒng)直接促進(jìn)MAVS的K63位泛素化修飾。以上結(jié)果表明,E3泛素連接酶TRIM31可以將MAVS的第10位,第311位,第461位賴氨酸進(jìn)行K63位泛素化修飾。8.TRIM31通過其E3泛素連接酶功能對(duì)RLR信號(hào)通路的影響為了進(jìn)一步驗(yàn)證TRIM31是否通過其E3泛素連接酶功能影響RLR信號(hào)通路,我們構(gòu)建了 TRIM31泛素連接酶功能缺失點(diǎn)突變過表達(dá)載體,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)、Western Blotting技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)缺失了 E3泛素連接酶功能后,TRIM31對(duì)RLR信號(hào)通路介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生失去了促進(jìn)作用,TRIM31的抗病毒作用也隨即消失。以上結(jié)論說明TRIM31通過其E3泛素連接酶活性促進(jìn)RLR介導(dǎo)的I型干擾素的產(chǎn)生及抗病毒作用。9.TRIM31促進(jìn)MAVS的多聚化TRIM31對(duì)MAVS進(jìn)行K63位泛素化修飾的機(jī)制我們已做了大量研究,然而TRIM31對(duì)MAVS修飾后如何調(diào)控MAVS的功能是我們進(jìn)一步要探討的重要問題。已有文章報(bào)道MAVS在RNA病毒感染后形成朊蛋白樣多聚體,該多聚體的形成對(duì)于MAVS進(jìn)一步活化下·游信號(hào)通路起到至關(guān)重要的作用,然而MAVS如何形成朊蛋白白樣多聚體還不得而知。因此我們進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TRIM31對(duì)MAVS的K63泛素化修飾是否促進(jìn)MAVS多聚體的形成。我們分別轉(zhuǎn)染空載體及TRIM31過表達(dá)載體于HEK293T細(xì)胞系,SeV感染不同時(shí)間點(diǎn)后,提取細(xì)胞線粒體,利用SDD-AGE技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRIM31過表達(dá)明顯促進(jìn)SeV介導(dǎo)的MAVS多聚體的形成。我們進(jìn)一步提取SeV預(yù)刺激后巨噬細(xì)胞的線粒體,與體外翻譯得到的TRIM31蛋白共同加入體外泛素化系統(tǒng),反應(yīng)結(jié)束后,SDD-AGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRIM31體外明顯促進(jìn)SeV介導(dǎo)的MAVS多聚體的形成。提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,SeV感染不同時(shí)間點(diǎn),提取線粒體蛋白,SDD-AGE技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRIM31敲除后明顯抑制SeV介導(dǎo)的MAVS多聚體的形成。以上實(shí)驗(yàn)表明TRIM31可以促進(jìn)MAVS朊蛋白樣多聚化的形成,進(jìn)而影響MAVS的活化及IFN-β的產(chǎn)生。10.基因恢復(fù)實(shí)驗(yàn)證明TRIM31特異性調(diào)控MAVS活化及RLR介導(dǎo)的信號(hào)通路我們提取TRIM31敲基因小鼠MEF細(xì)胞,分別轉(zhuǎn)染空載體及TRIM31過表達(dá)載體,SeV或VSV感染細(xì)胞,分別使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù),ELISA技術(shù),Western Blotting技術(shù)進(jìn)行檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn)TRIM31基因敲除后SeV誘導(dǎo)的MAVS形成朊蛋白樣多聚體的能力減弱,IFN-β產(chǎn)生減少,病毒復(fù)制明顯增加;重新過表達(dá)TRIM31后,由TRIM31缺陷導(dǎo)致的對(duì)RLR信號(hào)通路及病毒復(fù)制的影響隨即消失。以上結(jié)果進(jìn)一步證明了 TRIM31對(duì)于RLR介導(dǎo)信號(hào)通路的影響。我們同樣利用基因恢復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)了MAVS的K63位泛素化對(duì)RLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的影響,在MAVS特異性敲除MEF細(xì)胞中,重新轉(zhuǎn)染野生型MAVS過表達(dá)載體、K10、K311、K461位賴氨酸位點(diǎn)突變MAVS過表達(dá)載體與野生型TRIM31過表達(dá)載體、E3連接酶功能缺失點(diǎn)突變過表達(dá)載體載體,SeV或VSV感染一系列時(shí)間點(diǎn),利用實(shí)時(shí)熒光定量量PCR,雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù),Western Blotting技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),MAVS敲除后,SeV介導(dǎo)的RLR信號(hào)通路被阻斷,重新轉(zhuǎn)染野生型MAVS 后,RLR介導(dǎo)·的I型十?dāng)_素產(chǎn)生得到恢復(fù);TRIM31過表達(dá)促進(jìn)RLR介導(dǎo)的Ⅰ型十?dāng)_素的生成;然而轉(zhuǎn)染K10、K311、K461位賴氨酸位點(diǎn)突變MAVS表達(dá)載體后,RLR介導(dǎo)的信號(hào)通路的阻斷不能得到恢復(fù)。以上結(jié)果說明TRIM31對(duì)于MAVS的K10、K311、K461位賴氨酸位點(diǎn)的K63位泛素化直接影響MAVS活化及RLR信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。四.結(jié)論及創(chuàng)新性1.首次證明了 TRIM31在RLR信號(hào)通路中發(fā)揮作用TRIM31屬于TRIM家族中的一員,已有研究表明TRIM31在消化系統(tǒng)相關(guān)癌癥中發(fā)揮著重要作用。然而TRIM31是否參與到天然免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)目前還沒有報(bào)道。我們首先發(fā)現(xiàn)了 TRIM31在RNA病毒介導(dǎo)的天然免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及機(jī)體抗病毒反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。2.首次發(fā)現(xiàn)了對(duì)MAVS進(jìn)行K63位泛素化修飾的分子對(duì)于MAVS的泛素化修飾大多集中在K48位泛素化修飾,至今仍未發(fā)現(xiàn)對(duì)MAVS發(fā)生K63位泛素化修飾的分子,我們的發(fā)現(xiàn)填補(bǔ)了這一空白。我們發(fā)現(xiàn)TRIM31促進(jìn)IFN-β的產(chǎn)生,這一現(xiàn)象是通過其E3泛素連接酶對(duì)MAVS進(jìn)行K63位泛素化修飾引起的;同時(shí)我們明確了對(duì)TRIM31對(duì)MAVS泛素化修飾的位點(diǎn),分別是MAVS第10位,第311位,第461位賴氨酸。3.為探索影響MAVS多聚化形成的因素提供了新思路MAVS作為RLR信號(hào)通路重要的接頭蛋白,RNA病毒感染機(jī)體后,MAVS構(gòu)象發(fā)生改變,形成朊蛋白樣多聚體,該多聚體的形成是MAVS活化下游信號(hào)通路的前提條件,然而對(duì)于MAVS多聚化形成的調(diào)節(jié)機(jī)制并不明確。我們研究發(fā)現(xiàn),SeV感染后,TRIM31募集到線粒體上,并與MAVS結(jié)合并促進(jìn)MAVS發(fā)生K63位泛素化修飾,這種K63位的修飾調(diào)控MAVS朊蛋白樣多聚體的形成,進(jìn)而促進(jìn)IFN-β的產(chǎn)生,發(fā)揮抗病毒作用。4.為臨床抗病毒研究提供了潛在的治療靶點(diǎn)病毒感染仍舊是全世界面臨的重要問題,病毒的高變異性更給我們治療病毒性疾病帶來巨大的難度。我們研究發(fā)現(xiàn)TRIM31可以靶向MAVS促進(jìn)IFN-β的產(chǎn)生,發(fā)揮抗病毒作用。這一發(fā)現(xiàn),可以為臨床治療病毒感染性疾病提供新思路與治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R392
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本文編號(hào)：1269909