本文關(guān)鍵詞：二代測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于手足口病病原譜的研究

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【摘要】：手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是由多種腸道病毒(Enterovirus,EV)引起的一種常見于5歲以下兒童的急性傳染病。近年來,手足口病在我國(guó)呈持續(xù)性散發(fā)或暴發(fā)態(tài)勢(shì),有大量研究表明非EV71非CVA16的其他腸道病毒取代了 EV71和CVA16的主要地位,逐漸成為引起手足口病的優(yōu)勢(shì)病原。由于其他腸道病毒的型別多種多樣,單一或混合感染情況復(fù)雜多變,這給手足口病病原的準(zhǔn)確診斷帶來了極大挑戰(zhàn)。另外,在手足口病重癥和輕癥病例中,EV71/CVA16/其他腸道病毒通用型檢測(cè)均為陰性的病例數(shù)逐漸增多,其病原信息尚不明確,也尚無相關(guān)研究報(bào)道。因此應(yīng)用一種精準(zhǔn)的診斷技術(shù)來闡明手足口病重癥與輕癥病例的病原譜信息極為迫切和必要。二代測(cè)序技術(shù)作為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的主流手段,不依賴于已知序列信息,可對(duì)某一生境中的所有微生物核酸序列進(jìn)行并行測(cè)序和深入細(xì)致全貌的分析,尤其適用于病原復(fù)雜的手足口病。但因其運(yùn)行成本高昂、操作繁瑣、數(shù)據(jù)分析瓶頸和臨床樣本中的高背景問題,難以在臨床診斷中推廣使用。本研究首先利用分子條形碼標(biāo)識(shí)寡核苷酸引物(隨機(jī)六聚體和非核糖體六核苷酸)和一管式無片段化DNA池文庫(kù)的策略,建立了操作簡(jiǎn)便、成本低廉、直接鑒定病毒的快速二代測(cè)序平臺(tái)。采用三種已知病毒進(jìn)行模式試驗(yàn),結(jié)果顯示,分子條形碼標(biāo)識(shí)的寡核苷酸引物能夠捕獲到病毒序列信息,其中非核糖體六核苷酸引物捕獲到的病毒序列占比和獲得的模式病毒短序列的基因組覆蓋度均稍高于隨機(jī)六聚體引物。這表明非核糖體六核苷酸引物更適合用于病毒樣本的檢測(cè)。進(jìn)而,利用20份手足口病臨床樣本對(duì)基于分子條形碼標(biāo)識(shí)非核糖體六核苷酸引物的二代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行驗(yàn)證分析,結(jié)果顯示,該方法能準(zhǔn)確捕獲到手足口病病毒病原信息并對(duì)其進(jìn)行型別鑒定,同時(shí)還能鑒定出其他潛在病毒和甄別臨床誤診事件。這些結(jié)果表明,基于分子條形碼標(biāo)識(shí)寡核苷酸引物的二代測(cè)序平臺(tái)直接鑒定臨床樣本的病毒病原切實(shí)可行。為全面了解手足口病重癥與輕癥病例的病毒病原譜信息,以分析重癥與輕癥病例在病原構(gòu)成上的差異和試圖探索引起重癥病例的病原學(xué)因素,本研究應(yīng)用以上建立的二代測(cè)序平臺(tái)分別對(duì)94份重癥病例和150份輕癥病例臨床樣本進(jìn)行了測(cè)序分析。結(jié)果顯示,手足口病樣本中的病毒信息覆蓋了哺乳動(dòng)物病毒科和植物病毒科共 13 種病毒科的成員:Picornaviridae,Caliciviridae,Paramyxoviridae,Orthomyxoviridae,Parvoviridae,Astroviridae,Adenoviridae,Reoviridae,Anelloviridae,Virgaviridae,Alphaflexiviridae,Tymoviridae 和 Tombusviridae。其中,輕癥病例的病毒組分比重癥病例更為復(fù)雜。在輕癥病例中檢測(cè)到源于12個(gè)病毒科的38個(gè)病毒,而在重癥病例中則檢測(cè)到源于7個(gè)病毒科的21個(gè)病毒。同時(shí),在手足口病樣本中還檢測(cè)出了多種腸道病毒不同型別之間、腸道病毒與非腸道病毒之間的混合感染事件。所有病毒均通過分子生物學(xué)方法進(jìn)行再次驗(yàn)證,經(jīng)卡方檢驗(yàn)對(duì)病毒陽(yáng)性檢出病例數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)腸道病毒與呼吸道相關(guān)病毒的共存事件易發(fā)生于手足口病重癥病例(P=0.001),而腸道病毒與引起腹瀉相關(guān)病毒的共存事件易發(fā)生于輕癥病例(P0.001)。另外,利用生物信息學(xué)方法對(duì)二代測(cè)序數(shù)據(jù)組裝獲得的札如病毒全基因組序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析,進(jìn)化樹表明這株病毒為我國(guó)當(dāng)前的流行毒株。總之,本研究成功建立了直接鑒定病毒的二代測(cè)序平臺(tái),首次對(duì)隨機(jī)六聚體引物和非核糖體六核苷酸引物捕獲病毒信息的能力進(jìn)行了比較分析,并應(yīng)用該平臺(tái)首次初步闡明了手足口病重癥與輕癥病例的病毒病原譜,揭示了引起手足口病的腸道病毒多樣性和混合感染的復(fù)雜性,為手足口病的臨床診斷提供了一種精準(zhǔn)檢測(cè)方法,也為手足口病病原和相關(guān)疫情的確診初步提供了數(shù)據(jù)支持和參考依據(jù),對(duì)手足口病的預(yù)防控制具有重大意義。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R725.1

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本文編號(hào)：1269686