本文關鍵詞：Erbb4調(diào)控心臟再生的分子學特征

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【摘要】：一、背景與目的斑馬魚及新生乳鼠心臟再生能力的發(fā)現(xiàn)給再生醫(yī)學領域提供了重要的研究模型及方法。譜系追蹤技術于再生領域的應用證實,斑馬魚及新生乳鼠心臟損傷后再生的心肌細胞均主要來源于損傷區(qū)尚存心肌細胞的去分化及增殖。成人等成年哺乳動物心肌細胞多已退出細胞周期,自然狀態(tài)下無法發(fā)生去分化及增殖,這可能就是其心臟再生能力十分有限的原因。因此明確心肌細胞去分化及增殖的病理生理機制成為自然心臟再生研究的關鍵所在。Gemberling等人研究表明神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(Neuregulin1,Nrg1)是種強力的促心肌細胞分裂因子,即使沒有心臟損傷也可以激活斑馬魚心臟再生進程。并且在未受損傷心室中他們也檢測到erbb2(erb-b2 receptor tyrosine kinase 2)及erbb4b(erb-b2 receptor tyrosine kinase 4)在m RNA水平的表達,進而發(fā)現(xiàn)通過化學抑制劑阻斷Erbb2受體可以抑制斑馬魚心臟再生時的心肌細胞增殖。Bersell等人對小鼠的研究發(fā)現(xiàn),Nrg1可以通過促進細胞周期重啟而促進成鼠心臟再生及心梗后心功能恢復,而Erb B4是Nrg1誘導心肌細胞周期重啟必不可少的受體。該研究還發(fā)現(xiàn)Nrg1可以刺激單核心肌細胞增殖,但對多核細胞作用明顯減弱。而單核心肌細胞正是斑馬魚及新生7日(7days postnatal,P7)內(nèi)小鼠的主要心肌細胞類型。新生小鼠在P7后失去心臟再生能力,這與心肌細胞退出細胞周期的時間窗吻合。有趣的是,近期也有研究表明乳鼠出生后Erb B2受體表達顯著降低,而此時Nrg1誘導的心肌細胞增殖作用也明顯下降,提示Erb B2受體的減少可能是成年哺乳動物心肌細胞對Nrg1反應性下降的一個原因。Nrg1是一種細胞外生長因子,其受體為具有跨膜結(jié)構(gòu)的酪氨酸激酶家族,包括Erb B1,2,3,4。Erb B受體在Nrg1的誘導下可以形成二聚體,激活胞內(nèi)區(qū)域磷酸化而發(fā)揮活性作用。Erb B4是該家族受體中唯一既能與Nrg1直接結(jié)合又可發(fā)揮其酪氨酸激酶活性的受體,而Erb B2是一種共受體,并不能直接與Nrg1結(jié)合。另外,由于Erb B4在緊挨跨膜片段的膜外部分存在相對較長的“莖稈樣”(stalk)結(jié)構(gòu),在與Nrg1結(jié)合后,Erb B4可從該處發(fā)生蛋白水解斷裂,形成釋放入細胞外的120KDa的胞外部分以及80KDa的胞內(nèi)部分,該水解過程需要腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)化酶(Tumor Necrosis factor-α-converting enzyme,TACE)的參與。80KDa的胞內(nèi)部分在另一種膜蛋白γ分泌酶的作用下進一步水解斷裂而從細胞膜釋放入胞內(nèi)成為Erb B4-ICD(intracellular domain),進而可轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)作為一種轉(zhuǎn)錄因子參與細胞周期的調(diào)控。雖然目前Nrg1/Erb B信號通路對心臟再生的作用已經(jīng)得以明確,但對Nrg1重啟細胞周期的作用機制尚不清楚,其關鍵的直接受體Erbb4參與細胞周期重啟并調(diào)控心臟再生的具體作用機制尚不明確。因此,研究Erbb4受體在心臟中的表達模式對于其機制探索十分重要。本研究將通過對比可自然再生的模式生物與不可再生的成年哺乳動物心室中Erbb4的表達差異,結(jié)合Nrg1刺激作用下Erbb4受體的表達變化,為探索Erbb4重啟細胞周期的作用機制提供重要的數(shù)據(jù)資料。二、研究方法(一)斑馬魚及小鼠實驗操作選用6-8個月齡的AB野生型斑馬魚用于成年斑馬魚實驗。本研究使用的已發(fā)表的轉(zhuǎn)基因魚系有fli1α1:EGFP,wt1:EGFP,gata4:EGFP,cmlc2:Cre ER,β-act2:lox P-m TagBFP-STOP-lox P-Nrg1(β-act2:BSNrg1)。斑馬魚心尖切除術依據(jù)Poss發(fā)表的方法進行,分別于3dpa、7dpa及14dpa收集RNA、蛋白及組織學標本,并以未損傷心臟作為對照。小鼠實驗選取ICR/CD-1型孕鼠及2月齡成鼠。將孕期15日的孕鼠飼養(yǎng)至分娩,分別收集P1、P4、P8及2月齡成鼠心臟組織蛋白。為誘導斑馬魚心肌細胞表達Nrg1,將cmlc2:Cre ER與β-act2:BSNrg1魚系進行雜交,篩選出雙重轉(zhuǎn)基因魚系。將4-OH-Tamoxifen(4-HT)稀釋于丙二醇中,配制成濃度為10μmol的魚水并同時處理40dpf的Tg(cmlc2:Cre ER;β-act2:BSNrg1及β-act2:BSNrg1)斑馬魚,間隔4-5日重復1次,再過4-5日后收集心臟。為實現(xiàn)化學方法抑制TACE活性,對成年野生型斑馬魚行心尖切除術,于2-3dpa使用金屬蛋白酶抑制劑GM6001(濃度為10μM)的魚水處理,并收集心臟組織蛋白進行檢測。(二)實時定量聚合酶鏈反應(q RT-PCR)用TRIzol?以常規(guī)方法抽提uncut、3dpa及7dpa斑馬魚全心室RNA,用Super Script?III First-Strand synthesis試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為c DNA。采用Roche Light Cycler?480Real-Time PCR系統(tǒng)對erbb4進行定量PCR檢測,采集循環(huán)值,單個時間點至少重復三次實驗并以斑馬魚ef1α作為內(nèi)參。使用的引物序列為ef1α:F-AGCTCGTTGGAGTCAAC,R-TGCGCTGACTTCCTTGGTG;erbb4a:F-GTTGTGCCGTCGAACAATAG,R-CTGGCACTGATCCTCCTGA;erbb4b:F-ACTCAACGTGTTTCGCACTG,R-GCTCTGCCTCCAATAGTTGC。收集斑馬魚及小鼠心臟,去除心室外多余組織,根據(jù)組織體積加入相應量的細胞膜裂解液Buffer A(10 m M HEPES,PH=7.5;10 m M KCl;1 m M EDTA;2 m M Mg Cl2,1%NP40),勻漿并于500g×5min離心,吸取上清即為細胞漿蛋白。復洗后剩余部分加入50μl細胞核裂解劑Buffer B(Buffer A基礎上加500m M Na Cl及25%Glycerol),靜置后12000g高速離心,上清即為核蛋白。(四)蛋白免疫印跡檢測(Western Blot)采用Western Blot分別檢測斑馬魚再生過程、新生乳鼠及成鼠的全蛋白、核漿分離蛋白中的Erb B4、Tropomyosin、GAPDH的表達。組織全蛋白標本的提取采用RIPA裂解液。各蛋白樣品分別加入4×Sample Buffer及10×Reducing Buffer,配制成1×Sample Buffer。選用濃度為8%的預制凝膠,并使用iblot?轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜,修剪后用Odyssey Blocking Buffer于室溫下封閉1小時,4°C孵育一抗16小時。PBST洗滌3次,室溫避光孵育熒光二抗1小時。PBST洗滌3次后使用Odyssey紅外激光掃描成像系統(tǒng)檢測條帶信號。一抗?jié)舛葹?anti-Erb B4(1:1000),antiTropomyosin(1:1000),anti-GAPDH(1:1000)。二抗?jié)舛葹?anti-mouse(1:10000),anti-rabbit(1:10000)。(五)組織免疫熒光檢測1.組織切片免疫熒光染色將斑馬魚心臟組織制作成石蠟切片,脫蠟后加熱引導下于VECTOR抗原修復液中進行抗原修復,隨后使用組織切片封閉液(5%山羊血清,2.5%的馬血清及0.3%Triton X-100,稀釋于TBST)室溫下封閉45min。4°C下孵育一抗16小時,TBST洗滌3次,室溫下孵育二抗1小時,DAPI復染后封片。使用Zeiss LSM710共聚焦顯微鏡對切片進行檢測并攝圖。一抗及濃度:anti-Erb B4(1:200),anti-EGFP(1:500),antiTropomyosin(1:200)。二抗及濃度:anti-rabbit(1:200),anti-mouse(1:200),antiChicken(1:500),所有的組織切片檢測均依據(jù)研究員單盲實驗進行設計。2.全心組織熒光染色收集麻醉處死的fli1α:EGFP斑馬魚心臟,清洗后4°C下于4%的PFA固定24h,并于Dent’s液(25ml H2O2,10ml DMSO,40ml Me OH)漂白24小時,隨后Dent’s固定液(50ml DMSO,200ml Me OH)再次固定24小時。清洗后孵育一抗5天,洗去一抗并避光條件孵育二抗5天,洗去二抗并于BABB液(50ml benzyl alcohol,100ml benzyl benzoate)進行透明化處理后固定于1%瓊脂糖凝膠于共聚焦顯微鏡下攝片。(三)心室組織細胞核、細胞漿蛋白分離3.心肌細胞爬片熒光染色將24孔板中的心肌細胞爬片于4%PFA/PBS中固定10分鐘,打孔10分鐘后以封閉液封閉30分鐘,隨后一抗4°C下孵育16小時。PBS洗凈后室溫下避光孵育二抗30分鐘。DAPI復染后封片,以熒光顯微鏡攝片。一抗及濃度:anti-Erb B4(1:200)或anti-a-actinin(1:300)。二抗及濃度:488 anti-mouse(1:200)。(六)統(tǒng)計學分析Western Blot結(jié)果通過灰度測量軟件得到計量資料,以平均數(shù)±標準差表示,單組實驗數(shù)據(jù)重復3次及以上。兩組獨立樣本進行t檢驗,多因素樣本采用方差分析,以P0.05作為顯著性差異標準。三、研究結(jié)果(一)erbb4在斑馬魚心臟再生過程中的表達erbb4的m RNA檢測結(jié)果以ef1a作為內(nèi)參進行校正,結(jié)果顯示,在未損傷的斑馬魚心臟中均有erbb4a及erbb4b的表達。以未損傷斑馬魚心臟為對照,erbb4a及erbb4b的表達在7dpa時均顯著下調(diào)。(二)Erbb4在斑馬魚心臟再生過程中的表達Western Blot檢測結(jié)果表明Erbb4在斑馬魚心臟中主要以約60KDa的截短蛋白(Erbb4-ICD)形式存在,180KDa的全長蛋白含量相對較低。為了檢測Erbb4在空間分布,我們進行了免疫熒光染色,并進一步分離了核漿蛋白進行Western Blot檢測。熒光檢測結(jié)果顯示Erbb4表達于全心范圍而心肌細胞核區(qū)的表達豐度較高,并且在未損傷心臟及損傷心臟中均有表達。Western結(jié)果也顯示,在斑馬魚未損傷的心臟或者再生的心臟中,截短的Erbb4蛋白都主要表達于細胞核中,細胞漿中可檢測到全長蛋白及剩余的截短蛋白表達。斑馬魚未損傷心臟組織切片及全心掃描結(jié)果的免疫熒光共染色結(jié)果顯示,心肌細胞、心臟血管內(nèi)皮細胞及心外膜細胞均可檢測到Erbb4受體的表達,并且在心肌細胞內(nèi)的分布主要位于細胞核區(qū)。(三)Erb B4在新生乳鼠及成鼠心臟中的表達Western Blot檢測結(jié)果表明,在小鼠心臟中,Erb B4同樣主要以約60KDa的ICD與180KDa的全長蛋白兩種形式存在,Erb B4-ICD的表達量顯著高于全長蛋白。其中ICD主要分布在細胞核中,全長蛋白僅分布于細胞漿中。從P1到P8,這兩種形式的蛋白表達量均呈下降趨勢。與新生乳鼠相比,已退出細胞周期的成鼠心臟中Erb B4-ICD及全長蛋白均顯著減少。(四)Nrg1誘導未成年斑馬魚心肌細胞核中Erbb4的表達乳鼠及成鼠的對比研究表明心臟中的Erb B4-ICD及全長蛋白在小鼠心臟晚期發(fā)育階段逐漸減少。為探索斑馬魚心臟發(fā)育至成熟過程Erbb4的變化,我們對比了未成年斑馬魚與成年斑馬魚心臟中Erbb4的表達。組織石蠟切片熒光染色結(jié)果表明,未成年斑馬魚心肌細胞核中Erbb4的表達水平明顯低于成年斑馬魚。為探索Nrg1對Erbb4受體表達的影響,我們通過4-HT處理Tg(cmlc2:Cre ER;β-act2:BSNrg1)而誘導40dpf的斑馬魚心肌細胞特異性表達Nrg1,并以Tg(β-act2:BSNrg1)作為對照組,對55dpf的心臟石蠟切片行Erbb4及Tropomyosin的免疫熒光染色。結(jié)果顯示,Erbb4的心肌細胞核區(qū)染色明顯強于對照組,這表明心肌細胞過表達Nrg1可以誘導斑馬魚心肌細胞核中Erbb4的表達。(五)斑馬魚心肌細胞核內(nèi)ICD可能直接由erbb4翻譯而來TACE是Erb B4蛋白水解所必要的一種金屬蛋白酶,GM6001為基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑,可抑制TACE活性。對斑馬魚行心尖切除術后于2-3dpa予以10μM化學抑制劑GM6001處理,并提取心臟組織蛋白行的Western Blot檢測結(jié)果顯示,60KDa左右的Erbb4-ICD表達量未見顯著改變。這提示細胞核中的Erbb4-ICD可能并非來自全長蛋白的水解。對斑馬魚erbb4開放閱讀框的分析表明,erbb4除了可以翻譯成180KDa的全長蛋白外,也可以直接翻譯為大小約63KDa的碳-端蛋白,這與我們發(fā)現(xiàn)的60KDa左右的ICD分子量大小基本一致,說明核內(nèi)的Erbb4-ICD可能由erbb4以替代起始位點直接翻譯而成。四、結(jié)論(一)Erb B4在可自然再生的斑馬魚及新生乳鼠體內(nèi)主要有Erbb4-ICD及全長蛋白兩種形式,并分別存在于細胞核及細胞漿中。(二)在不具備再生能力的成鼠心臟中,Erb B4-ICD及全長蛋白在對應區(qū)域的表達顯著降低。(三)未成年斑馬魚心肌細胞核內(nèi)Erbb4的表達明顯低于成年斑馬魚,心肌細胞特異性過表達Nrg1可誘導細胞核區(qū)的Erbb4表達顯著增強。由于Erbb4全長蛋白并不分布于細胞核中,這表明Erbb4受Nrg1刺激后可能通過形式或位置的改變來參與細胞周期的調(diào)控。(四)抑制斑馬魚TACE活性,心室中Erb B4-ICD表達水平未見明顯變化,說明細胞核中60KDa的ICD可能并非主要由全長蛋白水解而來。對斑馬魚erbb4開放閱框的分析對比表明,細胞核中的Erbb4-ICD可能由由erbb4以替代起始位點直接翻譯而成。
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R54

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