本文關鍵詞：肉蓯蓉總苷對血管性癡呆大鼠學習記憶、p-tau蛋白表達及蛋白組學的實驗研究

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【摘要】：研究背景癡呆目前已經成為一個重要的全球健康問題,隨著人口老齡化的日趨凸顯,癡呆的發(fā)病率呈逐年遞增趨勢,這個問題的效應預計將在未來被顯著放大。臨床表現(xiàn)以進行性的認知功能減退,記憶力下降,且伴隨行為異常,直至影響其生活自理能力。因此,研究掌握血管性癡呆癥的發(fā)病機制,最優(yōu)先考慮的問題應該是預防和治療。中樞神經系統(tǒng)的損害,無論什么原因,都可能導致認知功能障礙。血管性癡呆是中樞神經系統(tǒng)損害導致癡呆的常見類型之一,是由于腦血管原因如缺血性卒中、出血性卒中導致的腦組織損傷,造成了相應部位神經元損害,影響了腦組織中的病理及生理變化,造成記憶、認知、行為等嚴重的認知功能障礙綜合癥。目前認為腦血管病相關認知能力的下降是比以前更常見,是導致神經退行性變的獨立危險因素。早期的觀點開始在二十世紀初期,認為老年血管性癡呆癥是由腦動脈硬化導致的。后在60年代,一些研究人員得出結論,腦梗死體積較大的患者,可能是發(fā)展為老年血管性癡呆的巨大危險因素。在70年代,Hachinski等人提出了一個新名詞多發(fā)腦梗死癡呆,暗含了多次腦梗死后的一個蓄積后果。隨著神經影像的快速發(fā)展,一些缺血性小血管病變,如白質病變,腔隙性腦梗死,最終可造成認知障礙。血管性癡呆(Vascular dementia, VD)最常見的病理學機制就是腦缺血導致的損害,腦供血可引起大腦缺氧,糖代謝程度降低等情況出現(xiàn),隨著病程的進展,最終可導致癡呆的發(fā)生。我國血管性癡呆疾病的患病率大致為1.1-1.3%的水平,年發(fā)病率處于5-9‰,并且隨著國人生活改善,生活行為方式的轉變以及社會環(huán)境及工作壓力的增加,呈現(xiàn)出逐年上升的態(tài)勢。VD不僅會影響病人的自我調節(jié)能力,同時也大大降低了生活質量,會令病人的家庭出現(xiàn)較大的經濟困難,甚至造成了沉重的社會經濟負擔,所以血管性癡呆的預防和治療的研究領域較為重要,也是熱點領域,這也就促使其成為我國當前急需重視和解決的社會和醫(yī)學問題。肉蓯蓉(Cistanche deserticola Ma)是寄生在沙漠中樹木梭梭根部的一種寄生植物,從梭梭中吸取所需的營養(yǎng)成份及水。素有人間“沙漠人參”的美譽,具有極高的藥理學價值,是中國名貴的傳統(tǒng)中藥材。已有相關研究證明其具有抗衰老作用,調整內分泌系統(tǒng)功能、促進機體代謝,增強免疫系統(tǒng)的免疫能力,保護肝臟、心臟及腦血管系統(tǒng)。本實驗所用成分為肉蓯蓉總苷,是從肉蓯蓉中提取而得,被廣泛用來作為一種具有神經保護作用的中藥成分,采用現(xiàn)代藥理學的相關研究方法,多項研究表明肉蓯蓉總苷可以防止小腦顆粒神經元凋亡,抑制caspase-3和caspase-8的活動而發(fā)揮其抗凋亡的影響。肉蓯蓉提取物通過增加神經細胞分化,軸突長度和突觸的形成來改善小鼠學習記憶[3]。但肉蓯蓉總苷對腦缺血后海馬神經元的研究及對認知功能的影響卻少有報道,特別是對腦缺血后海馬神經元蛋白組學的構成的研究國內外均未見報道。本研究采用2-VO方法致局灶性腦缺血誘發(fā)VD大鼠模型,并使用肉蓯蓉總苷對模型進行干預治療,通過行為性研究、蛋白組學技術及免疫組化等方法,為深入探討VD發(fā)病過程中可能的關鍵機制,及其防治新措施提供了實驗依據。第一部分血管性癡呆大鼠模型制備及肉蓯蓉對血管性癡呆大鼠模型行為學的影響VD是建立在腦血管病的基礎上,以記憶力、行為、認知等功能缺損為主。最常見的病理學機制就是腦缺血導致的損害,是老年癡呆中僅次于阿爾茨海默氏病的第二種常見類型。腦缺血可引起大腦缺氧,糖代謝程度降低等情況出現(xiàn)。海馬是學習記憶的高級活動中樞,對腦組織缺血、缺氧等損傷很敏感。本實驗采用2-VO大鼠模型,結扎Wistar大鼠雙側頸總動脈,這種模型制作簡單,且穩(wěn)定,是國內外公認的研究血管性癡呆的經典動物實驗模型。目前治療血管性癡呆缺乏特效藥物,肉蓯蓉總苷(glycosides of cistanche,GCs)是從新疆肉蓯蓉中提取,主要成分為苯乙醇總苷,對腦缺血、缺氧后腦細胞具有保護作用,本研究選擇奧拉西坦作為藥物對照組,利用Morris水迷宮實驗方法評估肉蓯蓉總苷對血管性癡呆模型大鼠學習記憶功能的保護作用。目的：制備大鼠血管性癡呆模型,研究肉蓯蓉總苷對血管性癡呆模型大鼠學習記憶功能障礙的改善作用。方法：將Wistar大鼠編號,按照隨機數(shù)字表順序,隨機分為假手術組、VD模型組、GCs治療組、奧拉西坦藥物對照組,后三組大鼠均用雙側頸總動脈結扎(2-VO法)建立血管性癡呆模型,VD模型組腹腔注射1ml生理鹽水,GCs組調整藥物濃度為給藥量1ml,腹腔注射劑量(10mg/kg/d),奧拉西坦藥物對照組調整藥物濃度為給藥量1ml,腹腔注射劑量(450mg/kg/d),連續(xù)用藥14天后,用Morris水迷宮實驗評價四組大鼠的空間學習記憶功能。結果：(1)Morris水迷宮實驗證實VD模型組的大鼠定位航行試驗的逃避潛伏期明顯延長,與假手術組比較有顯著性,具有統(tǒng)計學差異(pO.O5),從第1天起,VD模型組和假手術組逃避潛伏期差別無統(tǒng)計學意義,隨著訓練時間延長,第5天VD模型組逃避潛伏期為60.2±18.9s,假手術組則為32.5±9.9s,差異明顯增大。并且發(fā)現(xiàn)VD模型組隨著訓練天數(shù)的延長,逃避潛伏期也在逐漸縮短,訓練第1天逃避潛伏期是82.7±22.3s,第5天逃避潛伏期縮短為60.2±18.9s,可能與大鼠肢體訓練有關。(2)肉蓯蓉總苷治療后,第4、5天大鼠逃避潛伏期分別為41.2±20.0s,38.6±15.2s,與VD模型組比較有統(tǒng)計學差異(p0.05)；肉蓯蓉總苷組與奧拉西坦藥物對照組及假手術組比較無統(tǒng)計學差異。結論：本實驗對各組大鼠經歷Morris水迷宮平臺逃避潛伏期進行比較,發(fā)現(xiàn)從第1天起,VD模型組和假手術組逃避潛伏期差別不明顯,根據記錄的大鼠的路線圖分析,初始各組大鼠搜索平臺以隨機式或邊緣式為主,找到平臺的時間需要耗費比較長的時間,隨著觀察時間延長,第5天VD模型組逃避潛伏期較假手術組差異明顯增大。并且發(fā)現(xiàn)VD模型組隨著訓練天數(shù)的延長,逃避潛伏期逐漸縮短,可能與大鼠肢體訓練及從開始的隨機式或邊緣式尋找平臺,逐漸成為直線式尋找平臺有關。在使用肉蓯蓉總苷治療后,大鼠逃避潛伏期較VD模型組明顯縮短,提示給予肉蓯蓉總苷后大鼠學習記憶能力得到明顯改善。第二部分肉蓯蓉總苷對血管性癡呆大鼠蛋白組學及免疫組化研究VD是由腦血管疾病引起的,以認知功能損害為主,是老年癡呆的主要類型之一。肉蓯蓉總苷從傳統(tǒng)醫(yī)藥到現(xiàn)代藥理學的研究均證實其能起到神經保護作用tau蛋白是一種微管相關蛋白,主要有促進微管組裝,保持微管穩(wěn)定性及細胞骨架完整性,進一步穩(wěn)定軸漿運輸正常進行。在AD患者的腦組織中發(fā)現(xiàn)過度磷酸化的tau蛋白,提示該蛋白導致微管組裝能力下降,微管穩(wěn)定性差,影響突觸神經遞質的合成、轉運、攝取和釋放,最終可導致AD患者認知功能下降。蛋白質組學作為新興學科,系統(tǒng)研究各種生理及病理狀態(tài)下的蛋白質組成成分構成及活動規(guī)律,蛋白組學的出現(xiàn)為從蛋白質的整體水平上去探討和研究疾病的發(fā)生和發(fā)展機制和機理提供了一種可能。本文旨在通過磷酸化tau蛋白(p-tau)免疫組化的方法及利用蛋白質組學技術分析各組大鼠p-tau蛋白變化及VD模型海馬蛋白質組構成成分及使用肉蓯蓉總苷后,VD大鼠海馬蛋白質組構成發(fā)生的變化,為進一步研究探討VD可能的致病機制提供依據,也為肉蓯蓉總苷從藥理角度研究中樞認知功能提供了實驗依據。目的：制備大鼠血管性癡呆模型,研究肉蓯蓉總苷對血管性癡呆模型大鼠的學習記憶功能障礙的改善作用,從蛋白質組學及p-tau蛋白免疫組化方面探討其可能的保護機制。方法：將Wistar大鼠編號,隨機分為假手術組、VD模型組、GCs治療組、奧拉西坦藥物對照組,后三組大鼠均用雙側頸總動脈結扎(2-VO法)建立血管性癡呆模型,VD模型組腹腔注射1ml生理鹽水,GCs組調整藥物濃度為給藥量1ml,腹腔注射劑量(10mg/kg/d),奧拉西坦藥物對照組調整藥物濃度為給藥量1ml,腹腔注射劑量(450mg/kg/d),連續(xù)用藥14天后,用Morris水迷宮實驗評價四組大鼠的空間學習記憶功能。(同第一部分),完成行為學評估后取出大鼠海馬組織,用蛋白組學技術分析VD模型組關鍵蛋白,以及給予GCs后蛋白質組學變化。并通過免疫組化評估假手術組、VD模型組、GCs治療組、奧拉西坦藥物對照組的tau蛋白磷酸化水平。結果：(1)Morris水迷宮實驗證實VD模型組大鼠定位航行試驗的逃避潛伏期明顯延長；與假手術組比較有顯著性差異(p0.01)。肉蓯蓉總苷治療后,VD大鼠逃避潛伏期縮短；肉蓯蓉總苷組與奧拉西坦藥物對照組間無統(tǒng)計學差異；(同前一部分)(2)與假手術組比較,VD模型組篩選出21個差異蛋白點,經質譜(mass spectrometry,MS)分析最終鑒定出3個蛋白質表達上調,分別是：硫氧還蛋白樣蛋白(thioredoxin-like protein 1 TXL-1),雙重特異性絲裂原活化蛋白激酶激酶1(dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 MAPKK 1),二氫嘧啶酶相關蛋白(Dihydropyrimidinase-related protein 2 Dpysl2),1個蛋白質表達下。調是谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase GCL);與VD模型組比較,從GCs組發(fā)現(xiàn)共有15個差異蛋白點,最終鑒定上調蛋白2個,為蛋白熱休克蛋白75(heat shock protein 75 kDa Hsp75)和肌動相關蛋白3(actin-related protein 3 Arp3),下調的蛋白1個,為角蛋白,II型細胞骨架6A (keratin, type Ⅱ cytoskeletal 6A)。(3)免疫組化圖象定量分析,胞漿呈棕黃色染色為p-tau蛋白,每個標本各個區(qū)域隨機測量5個視野,每個視野選取5個陽性細胞測量平均灰度值。VD模型組p-tau蛋白水平高于假手術組(P0.05),使用GCs后,VD模型組p-tau蛋白水平較VD生理鹽水組明顯下降(P0.05),與奧拉西坦藥物對照組無差別。結論：VD模型組大鼠定位航行試驗的逃避潛伏期較假手術組明顯延長；表明VD大鼠模型制模成功。肉蓯蓉總苷治療后,大鼠逃避潛伏期縮短；且肉蓯蓉總苷組與奧拉西坦藥物對照組間無明顯差異,表明肉蓯蓉總苷對血管性癡呆導致的神經功能損害有保護作用(同前一部分)；經歷Morris水迷宮實驗的各組大鼠最終取出海馬組織,進行蛋白組學分析,發(fā)現(xiàn)VD模型組篩選出21個差異蛋白點,經質譜分析最終鑒定出3個蛋白質表達上調,分別是：硫氧還蛋白樣蛋白,雙重特異性絲裂原活化蛋白激酶激酶1,二氫嘧啶酶相關蛋白,1個蛋白質表達下調是谷胱甘肽合成酶；從肉蓯蓉治療組發(fā)現(xiàn)共有15個差異蛋白點,最終鑒定上調蛋白2個,為蛋白熱休克蛋白75和肌動相關蛋白3,下調的蛋白1個,為角蛋白,Ⅱ型細胞骨架6A,這些蛋白質功能涉及能量代謝、抗氧自由基、信號轉導、神經元極性及軸突形成等多個病理生理過程,為進一步研究探討VD可能的致病機制提供依據。免疫組化結果提示：VD模型組tau蛋白磷酸化水平(p-tau)較假手術組明顯增高,提示與微管蛋白結合程度下降,導致維持微管功能穩(wěn)定性降低,造成神經纖維退化甚至功能缺失。tau蛋白的過度磷酸化水平可能是血管性癡呆的主要病理改變,肉蓯蓉總苷干預后,tau蛋白磷酸化水平明顯下降,可改善微管組裝活性,從而進一步改善神經遞質的合成、轉運、攝取和釋放。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R749.16

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