發(fā)布時間：2017-12-07 06:19

  本文關(guān)鍵詞：外泌體在非小細胞肺癌預(yù)后中的作用及其機制研究

  更多相關(guān)文章： 外泌體 非小細胞肺癌 預(yù)后 微小RNA 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變

【摘要】：肺癌是導(dǎo)致全球死亡病例最多的惡性腫瘤之一,5年生存率僅約15.6%。非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)占肺癌的80%-85%,主要包括肺腺癌、肺鱗癌和大細胞癌等。病理類型、腫瘤分期等臨床特征是惡性腫瘤重要的預(yù)后因素。近期發(fā)現(xiàn),液相活檢比如循環(huán)外泌體(circulating exosome,crExo),也能為惡性腫瘤提供重要的預(yù)后信息。外泌體是起源于內(nèi)體的、直徑30nm-150nm的細胞外囊泡。外泌體中有多種類型的分子,包括蛋白質(zhì)、miRNA、m RNA、DNA等。且外泌體參與細胞之間的物質(zhì)交換和信息傳遞,從而發(fā)揮生物學(xué)功能。許多惡性腫瘤的crExo內(nèi)含物不同于非腫瘤人群,并且可能和腫瘤的進展情況密切相關(guān)。有證據(jù)表明,crExo中的內(nèi)含物比如RNA、蛋白質(zhì)等,可作為某些惡性腫瘤的生物標志物。為了探討外泌體在NSCLC患者中的預(yù)后作用及其機制,本文進行了如下研究:第一章血漿中外泌體濃度在非小細胞肺癌預(yù)后中的作用目的研究血漿中crExo濃度與NSCLC患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。方法將血漿crExo用商業(yè)化試劑分離后,用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)、western blot及Nano Sight進行鑒定。使用乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,ACh E)法、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法和納米顆粒追蹤分析技術(shù)(nanoparticle tracking analysis,NTA)定量20個NSCLC患者crExo濃度,并分析這三種方法結(jié)果之間的關(guān)聯(lián)性。選擇與NTA法關(guān)聯(lián)性更強的定量方法測定NSCLC患者的crExo濃度。并分析crExo濃度與NSCLC患者的臨床特征及總生存期(overall survival,OS)之間的關(guān)系。結(jié)果1、分離的crExo樣品電鏡下為圓形,直徑在30nm-100nm之間。western blot結(jié)果表明,crExo樣品表達外泌體標志物蛋白CD63和CD9,輕微表達albumin,而不表達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白標志物calnexin。Nano Sight結(jié)果表明,樣品粒徑在50nm-150nm之間,粒徑眾數(shù)為73nm。這些結(jié)果說明,用本法分離crExo是可行的。2、三種外泌體定量方法(BCA法、ACh E法和NTA法)的結(jié)果之間彼此相關(guān)。ACh E法與NTA法的關(guān)聯(lián)強度(r=0.79,P0.001)要大于BCA法與NTA法的關(guān)聯(lián)強度(r=0.64,P=0.003)。3、采用ACh E法測定208例NSCLC患者crExo濃度,發(fā)現(xiàn)晚期(IIIb-IV期)患者的crExo濃度高于早期(I-IIIa)患者(P0.001),合并COPD的患者crExo濃度高于未患COPD的患者(P=0.023)。crExo濃度在不同性別、不同吸煙狀況或不同病理類型的NSCLC患者之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。crExo濃度與NSCLC患者的年齡也沒有統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)。4、Cox比例風險模型結(jié)果提示,校正吸煙狀態(tài)、腫瘤分期、手術(shù)及化療因素后,高濃度crExo是NSCLC患者獨立不良預(yù)后因子(P=0.033;HR=1.72,95%CI:1.05-2.83)。時間依賴性受試者工作特征曲線下面積(area under the ROC curve,AUC)結(jié)果表明,加入crExo濃度這一因素使得Cox模型預(yù)測結(jié)局的效能總體趨于好轉(zhuǎn)。但是,在隨訪6個月、12個月、18個月及24個月時,兩個模型預(yù)測結(jié)局能力的差異都沒有統(tǒng)計學(xué)意義結(jié)論crExo濃度與NSCLC患者的腫瘤分期及是否合并COPD有關(guān),并可作為NSCLC患者獨立預(yù)后因子。第二章血漿中外泌體miRNA在非小細胞肺癌預(yù)后中的作用目的探討肺腺癌與健康對照crExo中miRNA表達譜的差異,并研究crExo miRNA在NSCLC患者預(yù)后中的意義。方法用miRNA芯片檢測10例肺腺癌和10例匹配(年齡、性別、吸煙狀況)健康對照的crExo miRNA表達譜。用18個crExo樣品評估四個候選內(nèi)參基因(SNORD49A、let-7a-5p、miR-30a-5p和miR-30e-5p)的穩(wěn)定性。根據(jù)芯片結(jié)果并結(jié)合既往文獻,選擇若干crExo miRNA以研究它們在NSCLC患者預(yù)后中的作用。結(jié)果1、芯片檢測的84個miRNA中,有25個miRNA和5個miRNA在肺腺癌患者crExo中分別為低表達和高表達。2、內(nèi)參評估結(jié)果表明,在四個候選crExo內(nèi)參基因中,let-7a-5p最穩(wěn)定。3、根據(jù)miRNA芯片差異表達結(jié)果及相關(guān)文獻,選擇9個crExo miRNA(miR-23b-3p、miR-10b-5p、miR-19a-3p、miR-194-5p、let-7g-5p、miR-141-3p、miR-21-5p、miR-375和miR-1290),以評估它們在NSCLC患者預(yù)后中的意義。其中,crExo miR-21-5p、miR-375和miR-1290是通過文獻復(fù)習而選擇的。結(jié)果表明,miR-21-5p、miR-375和miR-1290均在NSCLC患者crExo中高表達。4、以let-7a-5p為內(nèi)參,使用q PCR檢測196例NSCLC患者crExo中以上9個miRNA的表達。Cox比例風險模型表明,crExo中miR-23b-3p(P=0.001;HR=2.42,95%CI:1.45-4.04)、miR-10b-5p(P=0.013;HR=2.22,95%CI:1.18-4.16)和miR-21-5p(P=0.003;HR=2.12,95%CI:1.28-3.49)為NSCLC患者獨立預(yù)后因子。時間依賴性AUC結(jié)果表明,加入這三個crExo miRNA后,Cox模型預(yù)測結(jié)局的效能整體好轉(zhuǎn)。在隨訪12個月時,AUC從0.88增大到0.91(P=0.015)。結(jié)論肺腺癌患者與健康對照相比,crExo的miRNA表達譜有統(tǒng)計學(xué)差異。let-7a-5p可作為crExo miRNA定量研究中的內(nèi)參基因。crExo中的miR-23b-3p、miR-10b-5p及miR-21-5p表達水平可作為NSCLC患者獨立預(yù)后生物標志;與單純用臨床指標的預(yù)后模型相比,加入這三個crExo miRNA可以增加模型預(yù)后預(yù)測的效能。第三章肺癌細胞外泌體在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變中的作用研究目的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition,EMT)與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)。本部分主要目的是研究肺癌細胞外泌體在EMT中的作用。方法TGF-β1刺激A549肺腺癌細胞后,通過形態(tài)學(xué)觀察及EMT標志物(E-cadherin、N-cadherin及Vimentin)的檢測,評估A549細胞是否發(fā)生EMT。采用超速離心法分離A549細胞條件培養(yǎng)基中的外泌體(conditioned medium-derived exosome,CM-Exo),并用TEM、Nano Sight和western blot對CM-Exo進行鑒定。確定CM-Exo miRNA最穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因后,檢測A549細胞及其CM-Exo在EMT過程中8個miRNA(miR-23b-3p、miR-10b-5p、miR-194-5p、let-7g-5p、miR-19a-3p、miR-21-5p、miR-1290和miR-375)的表達。用PKH67熒光染料標記CM-Exo后,觀察肺癌細胞能否攝取CM-Exo。并研究CM-Exo能否促進A549肺癌細胞發(fā)生EMT。結(jié)果1、TGF-β1誘導(dǎo)后,A549細胞發(fā)生了符合EMT特征的形態(tài)變化及分子特征變化。本研究中,與Vimentin及N-cadherin相比,上皮性標志物E-cadherin是更加敏感的EMT標志物。2、TEM、Nano Sight和western blot結(jié)果均表明,超速離心法分離的CM-Exo樣品符合外泌體的特征。3、用q PCR檢測了12個CM-Exo樣本中四個候選內(nèi)參let-7a-5p、5s r RNA、miR-16-5p和U6的表達。用在線工具Ref Finder分析q PCR數(shù)據(jù),結(jié)果表明U6是CM-Exo最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。4、發(fā)生EMT的A549細胞中,8個miRNA表達均下調(diào)(FC[fold change,倍數(shù)變化]1.00,P0.05);其分泌的CM-Exo中則顯著富集了miR-21-5p(FC=6.03,P0.001)和miR-23b-3p(FC=2.96,P0.001),但miR-10b-5p的表達無顯著變化(FC=0.91,P=0.144)。此外,在發(fā)生EMT的細胞分泌的CM-Exo中,miR-1290(FC=0.27,P0.001)、miR-194-5p(FC=0.81,P=0.017)和miR-19a-3p(FC=0.57,P=0.006)表達水平下降;let-7g-5p(FC=1.55,P=0.013)、miR-375(FC=1.21,P=0.046)表達水平有所上升。5、肺癌細胞的CM-Exo能促進A549細胞發(fā)生EMT分子表型變化,且發(fā)生EMT的細胞分泌的CM-Exo促EMT效應(yīng)更明顯。結(jié)論發(fā)生EMT的肺癌細胞分泌的CM-Exo中顯著富集了miR-21-5p和miR-23b-3p,且能促進A549細胞EMT分子表型改變。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 任忠梅,楊秋安,張玉晶;晚期非小細胞肺癌患者外周血TNF-α檢測的臨床意義[J];山東醫(yī)藥;2000年18期

2 許運龍,郭昭揚,張云興,許賢榮;血管內(nèi)皮生長因子在人非小細胞肺癌中表達的臨床研究[J];中華腫瘤雜志;2000年05期

3 王繼營,高珊,崔黎,黃麗春,宋立友;“雙異”聯(lián)合治療晚期非小細胞肺癌37例[J];中國肺癌雜志;2000年02期

4 田靜,李蓓蘭;老年晚期非小細胞肺癌的化療:一種新趨勢[J];中國肺癌雜志;2000年05期

5 張世雯,周清華;不同的分割方案與化療聯(lián)合治療非小細胞肺癌[J];中國肺癌雜志;2000年05期

6 胡發(fā)明,華波;血清白介素-10水平是晚期非小細胞肺癌病人的一項預(yù)后因素[J];國外醫(yī)學(xué)(內(nèi)科學(xué)分冊);2000年11期

7 于亮,王梅,張燦灼;微血管在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義[J];泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2000年04期

8 朱建英;預(yù)計2009年非小細胞肺癌藥物市場將達20億美元[J];國外醫(yī)藥(合成藥 生化藥 制劑分冊);2001年02期

9 張利偉,劉樹秋,陳海英,萬錦華;立體定向適形放療配合常規(guī)放療治療非小細胞肺癌近期療效分析[J];黑龍江醫(yī)藥科學(xué);2001年05期

10 王肇炎;晚期非小細胞肺癌的解救化療[J];腫瘤研究與臨床;2001年01期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張新民;唐蜜;李代強;;磷酸化酪氨酸蛋白在非小細胞肺癌中的表達及其意義[A];中華醫(yī)學(xué)會病理學(xué)分會2006年學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2006年

2 胡旭東;楊國仁;霍宗偉;方永存;陳鳴陸;;~(99m)Tc-MIBI SPECT顯像觀察非小細胞肺癌多藥耐藥的研究[A];首屆全國腫瘤核醫(yī)學(xué)新技術(shù)研討會論文集[C];2007年

3 秦慶亮;熊海健;王愛;邊海蓉;盧振國;楊培英;朱斌耀;王蕓;;立體定向放射治療放療后復(fù)發(fā)非小細胞肺癌[A];2007第六屆全國放射腫瘤學(xué)學(xué)術(shù)年會論文集[C];2007年

4 馮耘;萬歡英;高蓓莉;項軼;劉嘉琳;;血管緊張素轉(zhuǎn)換酶二在非小細胞肺癌腫瘤生長和血管生成中的作用[A];中華醫(yī)學(xué)會第五屆全國胸部腫瘤及內(nèi)窺鏡學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2011年

5 ;非小細胞肺癌術(shù)后輔助治療及一線治療[A];天津市抗癌協(xié)會肺癌專業(yè)委員會2011年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2011年

6 蔣峰;許林;史美祺;;1560例非小細胞肺癌患者多因素預(yù)后分析[A];第13屆全國肺癌學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2013年

7 張華;;術(shù)前中性粒細胞和淋巴細胞比值對非小細胞肺癌患者預(yù)后的影響[A];第13屆全國肺癌學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2013年

8 王子平;;老年晚期非小細胞肺癌治療思考[A];第三屆中國腫瘤內(nèi)科大會教育集暨論文集[C];2009年

9 張沂平;;非小細胞肺癌個體化化療[A];2009年浙江省腫瘤學(xué)術(shù)年會暨腫瘤診治新進展學(xué)習班論文匯編[C];2009年

10 劉嘉湘;施志明;李和根;徐振曄;朱晏偉;趙麗紅;高虹;劉苓霜;朱惠蓉;張暉;;益肺抗瘤飲治療271例非小細胞肺癌臨床觀察[A];中醫(yī)藥優(yōu)秀論文選（下）[C];2009年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 記者 李穎;特羅凱對中國非小細胞肺癌患者效果佳[N];科技日報;2007年

2 曉白;非小細胞肺癌研究獲重大進展[N];人民日報;2008年

3 記者 張文天;非小細胞肺癌中醫(yī)藥綜合醫(yī)療方案研究進展順利[N];科技日報;2009年

4 辛勇　張先穩(wěn);早期非小細胞肺癌的治療進展[N];中國中醫(yī)藥報;2004年

5 記者高新軍;專家提出 建非小細胞肺癌中醫(yī)臨床指南[N];中國中醫(yī)藥報;2009年

6 上海長海醫(yī)院呼吸科 夏陽 整理 邱志濤;非小細胞肺癌放虎歸山還是乘勝追擊[N];健康報;2013年

7 記者 王丹;新研究揭示炎癥促非小細胞肺癌發(fā)生機制[N];健康報;2014年

8 記者 李穎;凱美納成晚期非小細胞肺癌治療優(yōu)選方案[N];科技日報;2014年

9 白京麗;非小細胞肺癌最佳治療方案[N];中國醫(yī)藥報;2000年

10 ;表皮生長因子受體抑制劑在治療非小細胞肺癌中的作用[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2005年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉慶云;外泌體在非小細胞肺癌預(yù)后中的作用及其機制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2017年

2 白艷（Bai Sally）;整合素αvβ5合并EGFR檢測用于非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后評估的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

3 王筱恬;PLZF和DACH1的異常表達影響非小細胞肺癌發(fā)生與發(fā)展的分子機制[D];復(fù)旦大學(xué);2012年

4 洪專;木犀草素治療EGF受體繼發(fā)性突變的非小細胞肺癌的實驗研究[D];南京大學(xué);2014年

5 張沛;ILT4在非小細胞肺癌中的作用及分子機制研究[D];山東大學(xué);2015年

6 王世坤;RBP2誘導(dǎo)非小細胞肺癌和食管鱗癌表皮間質(zhì)化[D];山東大學(xué);2015年

7 趙世俊;~(18)F-FDG PET/CT在非小細胞肺癌預(yù)后評估中的應(yīng)用研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

8 邱晨;影響非小細胞肺癌手術(shù)后遠期生存的相關(guān)因素分析[D];山東大學(xué);2015年

9 姜遠矚;術(shù)前血液學(xué)指標與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性非小細胞肺癌患者預(yù)后關(guān)系的研究[D];山東大學(xué);2015年

10 朱良明;STAT3及其靶基因?qū)Ψ切〖毎伟┥飳W(xué)行為調(diào)控機制的初步實驗研究[D];山東大學(xué);2015年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王勇;誘導(dǎo)型一氧化氮合酶在非小細胞肺癌中表達的臨床意義[D];中國醫(yī)科大學(xué);2006年

2 陳婷;非小細胞肺癌調(diào)強放射治療預(yù)后因素分析[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

3 王波;單向式全胸腔鏡下解剖性肺葉切除術(shù)治療早期非小細胞肺癌的學(xué)習曲線[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

4 施桂清;血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合放化療治療非小細胞肺癌的療效及安全性研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

5 王靜;Eg5、Ki-67在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

6 覃建穎;IL-21和Tc1細胞在非小細胞肺癌患者外周血及癌灶中的變化及相互作用[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2015年

7 張瑞;ⅢA-N2期非小細胞肺癌手術(shù)治療和放射治療的療效對比及相關(guān)預(yù)后因素的分析[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

8 石姣姣;基于多肽構(gòu)建抗腫瘤靶向藥物的應(yīng)用研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

9 胡世霖;非小細胞肺癌中醫(yī)辨證分型與Napsin A、TTF-1在肺癌組織中表達的相關(guān)性研究[D];福建中醫(yī)藥大學(xué);2015年

10 王婷婷;細胞因子活化殺傷細胞治療非小細胞肺癌臨床研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

，

本文編號：1261445