本文關鍵詞：淫羊藿苷及淫羊藿素通過GPER和IGF-1R抑制小膠質細胞炎癥反應保護多巴胺能神經(jīng)元的實驗研究

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【摘要】：帕金森病(Parkinson's Disease,PD)以黑質致密帶(substantia nigra par compacta,SNpc)多巴胺能神經(jīng)元的進行性變性、缺失為主要病變。越來越多的研究證明神經(jīng)炎癥在PD的發(fā)病中起著重要作用。小膠質細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)內的重要免疫感受效應細胞,研究指出多巴胺能神經(jīng)元易受炎癥侵襲的影響,PD患者的PET影像結果顯示小膠質細胞的活化與多巴胺能神經(jīng)元的喪失平行發(fā)生,提示炎癥反應和PD的發(fā)病密切相關。因此通過藥物的抗炎作用,保護中腦黑質多巴胺能神經(jīng)元,延緩PD的進展,成為PD治療的新策略。淫羊藿苷(icariin,ICA)是從淫羊藿中分離提取的黃酮類化合物,是淫羊藿的主要活性成分。研究顯示,口服ICA后,經(jīng)消化道內腸道菌群的水解反應,可生成淫羊藿素(icaritin,ICT)。文獻報道,ICA有神經(jīng)保護作用,能夠改善老年大鼠的認知障礙,激活海馬靜止狀態(tài)的神經(jīng)干細胞。ICA可以抑制原代培養(yǎng)下丘腦神經(jīng)元的凋亡。此外,ICA具有明顯的抗炎作用。Zeng KW等報道,ICA能通過抑制TAK1/IKK/NF-κB和JNK/p38 MAPK信號途徑,對抗脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)對原代培養(yǎng)的皮層小膠質細胞的激活作用。但在帕金森病炎癥模型,ICA是否能夠對抗炎性因子對中腦黑質多巴胺能神經(jīng)元的損傷及其詳細的抗炎機制,目前研究較少。近年來的研究顯示,ICT作為ICA的水解衍生物,屬于植物雌激素,具有類雌激素樣作用,能發(fā)揮雌激素樣的神經(jīng)保護作用和抗炎作用。但ICA和ICT是通過何種細胞膜靶蛋白發(fā)揮其抗炎作用,目前仍然不明確。G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(G protein-coupled estrogen receptor,GPER)是7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體家族中的一員。研究表明,雌激素的抗炎和神經(jīng)保護作用與GPER介導的快速非基因組效應密切相關。雌激素與GPER結合后,通過G蛋白,激活腺苷酸環(huán)化酶、磷脂酶C及生長因子受體等信號途徑,快速調控細胞的功能活動,發(fā)揮其生物學作用。研究報道,在黑質和紋狀體GPER廣泛表達,而且雌激素對多巴胺能神經(jīng)元的保護作用與GPER關系密切。Ma HR等報道,ICA、ICT可通過GPER、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)介導的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路刺激乳腺癌細胞SKBr3細胞的增生。我們課題組前期的工作證實ICT可通過胰島素樣生長因子-1受體(insulin-like growth factor-I receptor,IGF-1R)信號途徑對抗神經(jīng)毒素1-甲基-4苯基-吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion,MPP+)對多巴胺能神經(jīng)元MES23.5細胞的損傷。應用神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)制備的PD小鼠模型,證明ICA能夠對抗神經(jīng)毒素MPTP對黑質多巴胺能神經(jīng)元的損傷,其作用機制可能與MEK/ERK與PI3K/Akt信號通路的激活有關。鑒于以上研究背景,我們提出ICA、ICT是否通過GPER與IGF-1R介導的信號途徑發(fā)揮抗炎的神經(jīng)保護作用?我們研究的第一部分通過LPS作用于BV2小膠質細胞建立炎癥模型,從離體細胞水平探討GPER和IGF-1R在ICA、ICT抗炎機制中所發(fā)揮的作用。第二部分通過黑質內單側注射LPS建立去卵巢大鼠PD炎癥模型,從整體水平進一步探討ICA能否通過GPER和IGF-1R抑制小膠質細胞的炎癥反應從而保護DA能神經(jīng)元。1.淫羊藿苷(ICA)及淫羊藿素(ICT)通過GPER和IGF-1R抑制BV2小膠質細胞炎癥反應的實驗研究LPS建立BV2小膠質細胞炎癥模型,應用GPER阻斷劑G15或IGF-1R阻斷劑JB-1與ICA或ICT共同處理細胞,采用實時熒光定量PCR和免疫印跡技術,探究ICA和ICT通過GPER和IGF-1R發(fā)揮抗炎作用的機制。結果如下:(1)LPS組炎性因子TNF-α、IL-1β、COX-2和i NOS的m RNA表達水平明顯升高(P0.05)。不同濃度的ICA(1,10,20,50μM)、ICT(1,10,20,50μM)預保護,能不同程度地抑制以上炎性因子的基因表達,其中10μM和20μM的ICA和ICT作用最明顯(P0.05,P0.01,P0.001),在后續(xù)實驗中,我們選用10μM的ICA和ICT。(2)GPER阻斷劑G15能阻斷ICA、ICT在基因水平對LPS誘導的炎性因子TNF-α、IL-1β、COX-2和i NOS表達的抑制作用(P0.05,P0.01)。(3)IGF-1R阻斷劑JB-1亦能阻斷ICA、ICT在基因水平對LPS誘導的抑制炎性因子TNF-α、IL-1β、COX-2和i NOS表達的作用(P0.05,P0.01,P0.001)。(4)ICA及ICT能明顯抑制LPS誘導的BV2小膠質細胞COX-2和i NOS蛋白表達的增加(P0.01,P0.001),此作用可被G15或JB-1所阻斷(P0.05,P0.001)。(5)LPS組MAPKs蛋白(ERK、p38、JNK)的磷酸化水平明顯增加(P0.05,P0.01);ICA、ICT能不同程度地抑制LPS誘導的MAPKs蛋白的磷酸化水平(P0.05,P0.01,P0.001);G15或JB-1可阻斷ICA、ICT的保護作用(P0.05,P0.01,P0.001)。(6)LPS組IκB蛋白的磷酸化水平亦明顯增加(P0.05,P0.01);ICA、ICT能明顯抑制LPS誘導的IκB蛋白的磷酸化水平(P0.01,P0.001);此保護作用可被G15或JB-1所阻斷(P0.01)。上述結果提示,ICA、ICT能夠通過GPER和IGF-1R介導的信號通路抑制BV2小膠質細胞的炎癥反應。2.淫羊藿苷(ICA)通過GPER和IGF-1R抑制大鼠小膠質細胞炎癥反應保護黑質多巴胺能神經(jīng)元的機制研究采用黑質內單側注射LPS建立去卵巢大鼠PD炎癥模型,灌胃給予ICA(10mg/kg),通過腹腔注射阿撲嗎啡(apomorphine,APO)誘導大鼠的旋轉行為。采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)、實時PCR、免疫印記等多種評價方法,系統(tǒng)探討了ICA通過抑制炎癥反應保護多巴胺能神經(jīng)元的分子機制。結果如下:(1)旋轉行為:LPS炎癥模型組,APO誘導的大鼠旋轉圈數(shù)較對照組明顯增加(P0.001);ICA(10 mg/kg)給藥保護組的旋轉圈數(shù)與LPS組相比明顯減少(P0.001),此作用可被GPER阻斷劑G15或IGF-1R阻斷劑JB-1所阻斷(P0.001)。ICA單用組大鼠無明顯的旋轉行為。(2)HPLC結果顯示,損傷側LPS組紋狀體(striatum,Str)內的多巴胺(dopamine,DA)及其代謝產(chǎn)物高香草酸(homovanillic acid,HVA)、二羥基苯乙酸(dihydroxyphenylacetic acid,DOPAC)含量比對照組含量明顯減少(P0.001);ICA給藥組大鼠損傷側Str內的DA、DOPAC和HVA均明顯增高,與LPS組相比具有顯著差異(P0.05,P0.01),G15或JB-1可阻斷此作用(P0.05,P0.01,P0.001)。ICA單用組DA、DOPAC和HVA的含量與對照組沒有差異。(3)單側黑質注射LPS導致?lián)p傷側黑質內TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)目較未損傷側明顯減少,存活率只有未損傷側的37%;損傷側TH蛋白的表達也較對照組明顯減少(P0.01,P0.001);ICA給藥組大鼠損傷側TH陽性神經(jīng)元數(shù)目及TH蛋白的表達均明顯高于LPS組損傷側(P0.05,P0.01),TH陽性神經(jīng)元存活率均超過60%,此作用可被G15或JB-1阻斷(P0.05,P0.01)。ICA單用組TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)目和TH蛋白表達與對照組沒有差異。(4)免疫組化結果顯示LPS組損傷側黑質內小膠質細胞呈現(xiàn)過度激活態(tài),并且數(shù)目明顯增多;給予ICA保護后,能明顯抑制損傷側黑質內活化的小膠質細胞的數(shù)目及激活程度,此作用可被G15或JB-1阻斷。ICA單用組小膠質細胞沒有明顯的激活。(5)實時熒光定量PCR結果顯示,LPS組黑質內IL-1β、TNF-α和i NOS m RNA的表達水平明顯高于對照組(P0.001);而ICA給藥組炎性因子的m RNA表達水平則明顯降低(P0.01,P0.001);上述ICA的保護作用可以被G15或JB-1所阻斷(P0.05,P0.01)。ICA單用組黑質內IL-1β、TNF-α和i NOS m RNA表達與對照組沒有差異。(6)LPS組黑質內的COX-2和i NOS蛋白表達水平明顯高于對照組(P0.01);ICA能明顯抑制LPS組COX-2和i NOS蛋白表達的增加(P0.05,P0.001),此作用可被GPER阻斷劑G15或IGF-1R阻斷劑JB-1所阻斷(P0.05,P0.01)。ICA單用組黑質內COX-2和i NOS蛋白表達與對照組沒有差異。(7)LPS組損傷側黑質內ERK、P38及JNK的磷酸化水平明顯高于對照組(P0.05,P0.01);而ICA+LPS組上述蛋白的磷酸化水平則被明顯抑制(P0.05,P0.01),此作用可被G15或JB-1所阻斷(P0.05)。(8)LPS組損傷側黑質內IGF-1R表達明顯低于對照組(P0.01);而ICA+LPS組IGF-1R的表達與LPS組相比明顯上調(P0.01),G15或JB-1可阻斷ICA的保護作用(P0.05)。以上結果提示,ICA可通過GPER、IGF-1R信號途徑抑制小膠質細胞的炎癥反應,減輕其對黑質DA能神經(jīng)元的損傷。結論:在離體細胞水平,ICA、ICT能夠對抗LPS誘導的BV2小膠質細胞的炎癥反應。在整體動物水平,ICA能夠抑制LPS導致的PD炎癥大鼠黑質小膠質細胞的過度激活從而保護DA能神經(jīng)元。GPER、IGF-1R信號途徑參與了ICA、ICT的抗炎神經(jīng)保護作用。本研究為PD的治療提供了新的實驗依據(jù)和靶點。
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R742.5

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