本文關(guān)鍵詞：埃博拉病毒VP35與抑制劑、碳納米管和dsRNA作用模式及機(jī)理的分子動力學(xué)模擬研究

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【摘要】：埃博拉病毒(EBOVs)通常會引起嚴(yán)重的出血熱癥狀,如果不進(jìn)行有效的治療一般會有很高的致死率,到目前為止還沒有有效的治療手段。具有多種功能的埃博拉病毒蛋白VP35在病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制和對人體的免疫逃逸中起著至關(guān)重要的作用,因此VP35被認(rèn)為是藥物設(shè)計和開發(fā)的潛在靶點。但傳統(tǒng)的實驗手段對埃博拉病毒VP35與配體以及其免疫逃逸機(jī)制的微觀機(jī)理的研究具有一定的局限性。本文利用分子動力學(xué)(MD)模擬的方法對VP35干擾素抑制域(VP35ⅡD)與潛在的小分子抑制劑吡咯烷酮類化合物GA017、碳納米管和dsRNA的結(jié)合模式以及作用機(jī)理進(jìn)行了研究。(1)VP35 ⅡD與GA017結(jié)合模式及作用機(jī)理的分子動力學(xué)模擬研究VP35ⅡD第一功能區(qū)(FBP)可以與埃博拉病毒核蛋白結(jié)合,在病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制中起著重要的作用。在這項研究中,我們用全原子分子動力學(xué)模擬的方法以及MM/GBSA能量分解的方法對野生型(WT),單突變型(K248A,K251A和I295A)和雙突變型(K248A/I295A)與GA017的結(jié)合模式及作用機(jī)理進(jìn)行了研究。模擬結(jié)果表明與GA017的結(jié)合使VP35 ⅡD的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,同時使VP35第一功能區(qū)(FBP)的口袋空間減小。計算結(jié)果還說明了靜電相互作用和范德華相互作用在VP35與GA017結(jié)合過程中起著主要作用。I295A單突變和K248A/I295A雙突變對VP35第一功能區(qū)的結(jié)構(gòu)具有很大的影響,1295A的突變致使氨基酸R300-G301-D302形成一個新的螺旋,而K248A/I295A雙突變導(dǎo)致氨基酸V294-I295-H296-I297形成的折疊消失。此外,結(jié)合能的計算表明I295A和K248A/I295A突變致使與GA017的結(jié)合能降低,而K248A和K251A突變使結(jié)合能有所升高。我們得到的研究結(jié)果與實驗結(jié)果具有較好的一致性,K248A/I295A雙突變基本上會導(dǎo)致VP35與小分子結(jié)合失敗。這里的實驗結(jié)果對日后進(jìn)一步設(shè)計對抗埃博拉病毒的小分子抑制劑具有一定的指導(dǎo)意義。(2)碳納米管與VP35 ⅡD結(jié)合模式及作用機(jī)理的分子對接及分子動力學(xué)模擬研究碳納米管具有很多相對于其他材料非常獨特的性質(zhì),引起了人們對其大量的研究,并且應(yīng)經(jīng)成功應(yīng)用于很多領(lǐng)域。同時,納米管也被發(fā)現(xiàn)在藥物輸運和作為抑制劑方面具有巨大的研究價值。本文利用分子對接的方法研究了不同長度不同直徑的單壁碳納米管(SWCNT)與VP35 ⅡD的對接,然后從中選取22個構(gòu)象進(jìn)行全原子分子動力學(xué)模擬,來研究不同尺寸納米管對蛋白結(jié)構(gòu)的影響以及納米管的最佳結(jié)合構(gòu)象,之后用全原子分子動力學(xué)模擬和MM/GBSA自由能計算的方法研究了 SWCNT與WT和突變型(K248A、I295A和K248A/I295A)之間的結(jié)合模式和作用機(jī)理。分子對接和分子動力學(xué)模擬結(jié)果表明隨著納米管長度和直徑的增大,對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性也產(chǎn)生了較大的影響,像VS7-a體系中,碳納米管插入到蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)中,對蛋白的空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了嚴(yán)重的破壞,再如VS10-b體系中碳納米管的作用致使殘基305-309形成的α螺旋與殘基238-252形成的αα螺旋遠(yuǎn)離,使得蛋白整體結(jié)構(gòu)變得松散不穩(wěn)定。通過對各個體系結(jié)合自由能的分析,我們發(fā)現(xiàn)隨著碳納米管長度的增長結(jié)合自由能也隨之增加,但是當(dāng)納米管長度增加到一定長度后,結(jié)合能基本上就不再增加了,而碳納米管直徑的變化不會對結(jié)合能產(chǎn)生太大的影響,但會對蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響。相對于 WT-SWCNT 體系,突變體系 K248A-SWCNT、I295A-SWCNT 和 K248A/I295A-SWCNT的結(jié)合自由能都有所降低,但是并不太顯著。說明關(guān)鍵殘基突變在一定程度上會影響到SWCNT與VP35 ⅡD的結(jié)合,但是影響并不太明顯。此外,SWCNT在與VP35 ⅡD結(jié)合過程中,范德華相互作用起著決定性的作用。該研究結(jié)果可以為納米管對蛋白毒性的研究提供理論上的參考。(3)VP35 ⅡD與dsRNA的相互作用及識別機(jī)制的分子動力學(xué)模擬研究VP35ⅡD中央功能區(qū)(CBP)可以識別并競爭性結(jié)合可以激活人體對病毒免疫反應(yīng)的雙鏈RNA(dsRNA)骨架和末端,從而實現(xiàn)病毒對人體的免疫逃逸。選擇性突變VP35 ⅡD CBP保守殘基可以使VP35 ⅡD喪失對dsRNA結(jié)合活性,從而削弱EBOV以VP35ⅡD為基礎(chǔ)的干擾素抑制。在這里,我們用全原子分子動力學(xué)模擬和結(jié)合自由能分析的方法并結(jié)合對VP35 ⅡDCBP的保守氨基酸進(jìn)行突變來研究VP35 ⅡD CBP與dsRNA的微觀作用機(jī)理,以期找出廢除VP35 ⅡD能識別和結(jié)合dsRNA的關(guān)鍵點。通過對達(dá)到平衡后的VP35ⅡD與dsRNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,我們發(fā)現(xiàn)殘基R312A/R322A雙突變會導(dǎo)致dsRNA與VP35 ⅡD的結(jié)合位點以及取向與WT-dsRNA完全不同,也就是說R312A/R322A雙突變會導(dǎo)致VP35 ⅡD失去結(jié)合dsRNA的功能。結(jié)合自由能的計算表明殘基R312A,R322A和K339A單突變會使VP35 ⅡD與dsRNA的結(jié)合自由能分別降低17.82,13.18和13.68kcal/mol。自由能分解表明關(guān)鍵殘基較大的結(jié)合能貢獻(xiàn)主要來源于較強(qiáng)的靜電相互作用,分析得出這主要是因為關(guān)鍵殘基(R312,R322和K339)帶有正電的側(cè)鏈與帶有負(fù)電的dsRNA骨架相互作用導(dǎo)致。R312A,R322A和K339A單突變雖然對VP35 ⅡDCBP的結(jié)構(gòu)沒有太大的影響,但是這些殘基的突變破壞了體系氫鍵網(wǎng)絡(luò)和CBP表面靜電勢的分布,從而很大程度上改變了 R312,R322等殘基對結(jié)合自由能的靜電相互作用的貢獻(xiàn)。模擬結(jié)果表明VP35ⅡDCBP端帽氨基酸主要作用是識別dsRNA末端,其與dsRNA的作用主要是范德華相互作用,而CBP內(nèi)的關(guān)鍵保守殘基R312,R322和K339可以通過其側(cè)鏈與dsRNA骨架較強(qiáng)的靜電相互作用使得dsRNA固定于CBP中,在dsRNA結(jié)合中起著至關(guān)重要的作用。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R373;TB383.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 ;Inhibition of M-MuLV reverse transcriptase activity by fullerene derivatives[J];Chinese Science Bulletin;2006年20期

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本文編號：1257749