TREK1通道阻滯劑篩選及其抗抑郁機制的探討

發(fā)布時間：2017-12-05 12:00

本文關鍵詞：TREK1通道阻滯劑篩選及其抗抑郁機制的探討

【摘要】：研究背景與目的：當前的抗抑郁藥低有效率低已成為抑郁癥治療最突出的臨床難題之一。近年來基因工程鼠研究表明TREK1亞型雙孔鉀離子通道(TWIK-related mechano-gated two pore K+ channel)是抗抑郁治療的靶點,阻斷該通道與提高抗抑郁劑療效相關。而藥物基因組學研究也表明TREK1基因多態(tài)性與抗抑郁劑耐藥有關。然而目前尚缺乏理想的TREK1通道阻斷劑,阻斷TREK1通道發(fā)揮抗抑郁效應的機制也知之甚少。因此本課題擬篩選高效TREK1阻滯劑,評估其抗抑郁療效,并進一步探討阻斷TREK1通道發(fā)揮抗抑郁樣作用的機制。方法： 1.通過分子克隆技術構建TREK1鉀通道重組質(zhì)粒TREK1-pCDNA3.1(+)/ pEGFP-Nl,并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚腎293細胞(Human embryonic kidney, HEK293),實現(xiàn)TREK1通道蛋白體外表達。2.利用鉈離子熒光高通量篩選法篩查中國科學院上海藥物所國家化合物庫,篩選可能阻斷TREK1通道的化合物；利用全細胞膜片鉗技術檢驗篩選化合物對TREK1鉀通道的敏感性、特異性。3.利用表面等離子體共振(Surface plasmon resonance, SPR)技術測定篩選化合物與TREK1和五羥色胺1A受體(5-hydroxytryptamine receptor 1A,5-HTRia)親和力。4.通過藥代動力學實驗確定篩選化合物干預動物模型的有效劑量。5.通過慢性不可預知溫和應激(Chronic unpredictable mild stress, CUMS)結(jié)合孤養(yǎng)法建立抑郁癥動物模型,給予篩選的TREK1阻斷劑、文獻報道的TREK1阻斷劑spadin和抗抑郁劑西酞普蘭進行干預,利用強迫游泳實驗(Forced swimming test, FST)、開場實驗(Open field test, OFT)及蔗糖水偏好實驗(Sucrose preference test, SPT)評估篩選化合物的抗抑郁療效。6.通過場電位電生理實驗測量阻斷TREK1后抑郁模型大鼠中縫核(Dorsal raphie nuclei, DRN) 5-HT能神經(jīng)元、前額葉(Prefrontal cortex, PFC)錐體神經(jīng)元場電位的變化。7.利用免疫印跡及real-time PCR方法檢測阻斷TREK1通道后2周及4周抑郁模型大鼠DRN、 PFC及海馬CA1/CA3區(qū)蛋白激酶A(Protein kinase A, PKA)、環(huán)磷酸腺苷反應原件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor, BDNF)表達變化。8.利用全細胞膜片鉗技術檢測5-HTR1A激動劑和拮抗劑對表達在HEK293細胞膜上TREK1通道鉀電流的影響；在原代培養(yǎng)的孕17天胎鼠海馬神經(jīng)元中分別應用篩選的TREK1阻斷劑和文獻報道的TREK1阻斷劑spadin,并同時給予5-HTR1A激動劑和拮抗劑干預24h,通過免疫印跡法觀察5-HTR1A功能對神經(jīng)元PKA、 CREB和BDNF信號分子表達的影響。結(jié)果：1.高通量篩選的化合物SID1900抑制TREK1通道熒光強度的IC50值為28.72+3.67μM,該化合物在0mV下阻斷TREK1通道鉀電流的ICso值為29.72+2.4μM,，且.對原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元雙孔鉀離子通道(Two pore K+ channel, K2P)具有特異性阻斷作用(p0.001,1C50=87.09±4.2μM),對Na+、Ca2+和混合K+離子通道無顯著影響(p0.05)。2.SPR動力學數(shù)據(jù)顯示：不同濃度SID1900與TREK1鉀離子通道均具有較高親和力,平衡解離常數(shù)(KD)為1.905×10-10M。3.藥代動力學數(shù)據(jù)表明：SID1900可通透大鼠血腦屏障(通透率78.74%)且生物利用度良好(78.03±9.65%),有效干預劑量為14.33 μM/kg。4.與CUMS應激抑郁模型組相比,SID1900干預2周可顯著減少大鼠FST不動時間p0.001),療效早于西酞普蘭一周；另外在改善大鼠OFT水平活動、垂直活動評分及恢復蔗糖水偏好性方面,SID 1900也顯著優(yōu)于西酞普蘭(p=0.001,p＜0.001, p=0.031),與spadin一致。5.場電位電生理實驗結(jié)果表明：用SID 1900 (14.33 μM/kg, i.p.)干預4周后,應激抑郁大鼠DRN區(qū)5-HT能神經(jīng)元和PFC區(qū)錐體神經(jīng)元電沖動發(fā)放率(Firing rate)分別為：(4.35+0.61)Hz和(5.02±0.82)Hz,與模型組相比顯著增加(p=0.014,p=0.003),明顯高于西酞普蘭(p0.05),與spadin干預結(jié)果一致。另外SID 1900、spadin和西酞普蘭分別于給藥6min、 7min40s和9min40s后顯著增加CUMS模型大鼠DRN區(qū)5-HT能神經(jīng)元firing rate。 6. real-time PCR和免疫印跡檢測結(jié)果表明：SID1900干預CUMS模型大鼠2周可顯著上調(diào)中縫核、海馬CA1/CA3和PFC區(qū)PKA、 CREB和BDNF mRNA及BDNF蛋白表達(與模型組相比p0.001),這與spadin干預2周和西酞普蘭干預4周的結(jié)果接近。7.在0mV下30μM5-HTR1A激動劑8-OH-DPAT可增強19.14±1.34% TREK1通道鉀電流,而10μM5-HTR1A拮抗劑WAY 100635可阻斷17.18±1.26% TREK1鉀電流；在原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中同時應用8-OH-DPAT和SID1900較單獨應用SID1900對上調(diào)PKA-CREB-BDNF表達效果更顯著(p0.05),而同時給予WAY100635和SID1900與單獨應用SID1900相比,PKA-CREB-BDNF表達顯著降低(p0.05)。另外,SPR數(shù)據(jù)顯示：不同濃度SID1900與5-HT1A受體均具有較低親和力,平衡解離常數(shù)(KD)為2.597×10-4M。結(jié)論 1.本研究篩選的化合物SID1900可有效阻斷TREK1通道,對雙孔鉀離子通道具有較高特異性； 2.SID1900可順利通透血腦屏障且生物利用度良好,干預應激抑郁大鼠模型可產(chǎn)生顯著抗抑郁樣反應；3.5-HTR1A在阻斷神經(jīng)元TREK1通道后上調(diào)PKA-CREB-BDNF表達過程中可能發(fā)揮重要的協(xié)同作用；4.SID1900發(fā)揮抗抑郁樣效應可能與阻斷TREK1通道后增強5-HT傳遞、5-HTR1A協(xié)同效應及中縫核、PFC和海馬CA1/CA3區(qū)PKA-CREB-BDNF信號表達有關。
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R749.4

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本文編號：1254723

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