本文關(guān)鍵詞：自噬在天然小分子化合物促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞死亡中的作用及其機(jī)制研究

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【摘要】：天然材料作為藥物的重要來源,是人類防治疾病的主要策略之一。近年來惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率逐年上升,已成為威脅人類健康的重要因素。其中前列腺癌(prostate cancer, PCa)是歐美國家男性最常見的惡性腫瘤,是僅次于肺癌的第二大男性致死癌癥。雖然我國前列腺癌的發(fā)病率明顯低于西方國家,但隨著老齡人口的增多、工業(yè)化環(huán)境污染的加重和飲食生活習(xí)慣的改變以及前列腺特異抗原篩查的逐步推廣,其發(fā)病率呈逐年增加趨勢。目前內(nèi)分泌治療是治療早期前列腺癌的標(biāo)準(zhǔn)手段之一,然而大多數(shù)患者經(jīng)內(nèi)分泌治療1-2年后易發(fā)展為激素難治性前列腺癌(Hormone Refractory Prostate Cancer,HRPC),表現(xiàn)出對雄激素撤除不敏感,惡性程度高,目前臨床尚無理想的治療方法。由于惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,臨床上腫瘤耐藥時有發(fā)生,故單一的治療方案或針對于某一細(xì)胞信號途徑的化療藥物很難取得令人滿意的效果。從天然資源中尋求高效低毒且具有多機(jī)制抑癌活性的新型天然抗腫瘤藥物為癌癥治療提供了新思路。自然界數(shù)以百萬計的植物、動物、微生物和海洋生物是新藥研發(fā)的重要來源,從特殊生物資源中發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物已是目前國際藥物研究的主流方向。第一部分天然化合物抗腫瘤活性與誘導(dǎo)自噬活性篩選前列腺癌易發(fā)展為雄激素非依賴性HRPC,化療仍是治療HRPC的主要手段之一,但目前所用化療藥物的臨床治療效果和預(yù)后均不理想。近年來,多種植物來源的天然小分子化合物由于其廣泛而獨(dú)特的生物學(xué)活性而備受關(guān)注,特別是其潛在的抗腫瘤活性更是現(xiàn)下研發(fā)熱點(diǎn)之一。在本研究中通過對28種天然小分子化合物進(jìn)行了抗腫瘤和誘導(dǎo)自噬活性篩選,并初步研究和分析了純化于地衣的新型五環(huán)三萜酸Retigeric acid B(RB)和純化于黑曲霉菌的環(huán)肽類Malformin A1(MA1)對前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)活性的影響,取得了以下研究結(jié)果：一、天然化合物抗腫瘤活性和誘導(dǎo)自噬活性篩選通過對28種天然化合物的抗腫瘤活性和誘導(dǎo)自噬活性篩選,首次確定五環(huán)三萜類化合物RB和環(huán)肽類化合物MA1同時對前列腺癌細(xì)胞具有顯著的增殖抑制作用和不同程度的誘導(dǎo)自噬活性。體外抗腫瘤活性篩選顯示,前列腺癌細(xì)胞對RB敏感性最高,激素依賴型LNCaP細(xì)胞的IC50為7.97μM；非依賴型PC3和DU145的IC50稍高,約10μM;相比癌細(xì)胞,RB對正常前列腺上皮細(xì)胞的抑制活性弱；MA1顯著抑制前列腺癌細(xì)胞PC3和LNCaP的增殖,IC50分別為130nM和90nM；而對前列腺正常上皮細(xì)胞RWPE1抑制作用稍弱,IC50高于200nM。通過穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3 B的U87細(xì)胞中綠色熒光點(diǎn)狀斑點(diǎn)的分布和數(shù)量為指標(biāo)進(jìn)行的自噬活性篩選結(jié)果顯示,12種天然倍半萜類均對自噬的誘導(dǎo)效果微弱,12種天然三萜類中僅RB表現(xiàn)出中等程度的自噬誘導(dǎo)作用,其他影響不大；而同來源于地錢內(nèi)生真菌黑曲霉的四種化合物中,MA1對自噬的誘導(dǎo)作用強(qiáng);而其他3種化合物基本無影響。二、RB抑制前列腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡1.Transwell實(shí)驗(yàn)顯示,經(jīng)RB處理的激素非依賴性前列腺癌PC3和DU145細(xì)胞穿透matrigel膠的能力呈現(xiàn)濃度依賴性降低,表明腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的減弱。2.RB誘導(dǎo)PC3細(xì)胞發(fā)生S期細(xì)胞周期阻滯、抑制DNA合成,并RB誘導(dǎo)凋亡。流式細(xì)胞術(shù)分析表明RB濃度依賴性誘導(dǎo)PC3細(xì)胞發(fā)生S期阻滯；RB通過調(diào)控PC3細(xì)胞中的周期相關(guān)調(diào)節(jié)因子,包括細(xì)胞周期蛋白cyclin A、cyclin E、cyclinB的表達(dá)和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤抑制蛋白Rb的磷酸化水平,對其周期施加影響。BrdU摻入實(shí)驗(yàn)表明RB抑制DNA合成,并下調(diào)增殖細(xì)胞核抗原PCNA的表達(dá)水平；DAPI染色顯示RB誘導(dǎo)PC3細(xì)胞發(fā)生凋亡的形態(tài)學(xué)特征；RB濃度依賴性下調(diào)Bcl-2表達(dá)水平,Bax隨之累積,Bax/Bcl-2匕例升高導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對RB誘導(dǎo)凋亡的敏感性；RB誘導(dǎo)caspases活化,促進(jìn)PARP剪切,從而誘導(dǎo)凋亡。4.RB抑制LNCaP細(xì)胞中AR的轉(zhuǎn)錄活性并誘導(dǎo)凋亡。RB濃度依賴性抑制AR的蛋白表達(dá)水平；RB濃度依賴性抑制AR目的基因雄激素應(yīng)答基因PSA的啟動子活性,并抑制PSA的分泌,說明RB抑制AR轉(zhuǎn)錄活性。RB濃度依賴性激活caspase-3,并促進(jìn)PARP的剪切,從而誘導(dǎo)凋亡。三、MA1誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡和壞死1.MA1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。AnnexinV-FITC/PI雙染表明,MA1顯著誘導(dǎo)PC3和LNCaP細(xì)胞發(fā)生凋亡；western blottin g結(jié)果顯示,MA1激活caspase 3,PARP發(fā)生剪切,并降低抗凋亡蛋白Bcl-2水平；廣譜caspase抑制劑z-VAD-fmk部分阻斷了MA1誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡,說明其他類型的細(xì)胞死亡方式的存在。2.MA1誘導(dǎo)細(xì)胞壞死。PI染色顯示MA1處理PC3和LNCaP細(xì)胞后,時間依賴性引起細(xì)胞壞死,伴隨LDH大量泄漏；同時定量PCR結(jié)果顯示,MA1誘導(dǎo)炎癥因子的過表達(dá),引起炎癥反應(yīng)。第二部分自噬影響Retigeric acid B和Malformin A,抗腫瘤活性的機(jī)制研究自噬(autophagy)是由溶酶體所介導(dǎo)的細(xì)胞對自身的降解機(jī)制。其作用過程為：雙層膜包裹細(xì)胞內(nèi)的組分形成自噬泡,與溶酶體融合形成自噬溶酶體,通過溶酶體中酸性水解酶將其所包裹的內(nèi)容物消化和降解,從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞對于本身的代謝活動需要以及細(xì)胞器的更新。自噬的作用屬于細(xì)胞應(yīng)對營養(yǎng)缺乏、氧化應(yīng)激、損傷應(yīng)激、感染時的自我保護(hù)機(jī)制,但在強(qiáng)烈的應(yīng)激條件下,過度的自噬可作為一種細(xì)胞死亡程序誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬性死亡。近來研究證明,自噬,包括線粒體自噬,在腫瘤細(xì)胞中可被化療藥物引起的不同形式的細(xì)胞應(yīng)激所誘導(dǎo)。多種天然來源的抗腫瘤藥物如紫杉醇和喜樹堿能夠誘導(dǎo)自噬,對腫瘤進(jìn)展的控制和確定腫瘤細(xì)胞對化療的反應(yīng)具有重要性。基于第一部分的化合物篩選結(jié)果,我們對RB和MA1的誘導(dǎo)自噬的信號機(jī)制及其對前列腺癌細(xì)胞的抑制作用進(jìn)行了探討,取得了以下研究成果：一、RB通過阻斷PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)保護(hù)性線粒體自噬1.RB誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3B表達(dá)與LC3BII的形成�；蛐酒投縋CR數(shù)據(jù)顯示,RB誘導(dǎo)PC3和LNCaP細(xì)胞中自噬標(biāo)志蛋白LC3B上調(diào)約2.5-3.5倍,而其它自噬相關(guān)基因表達(dá)變化程度較小或無影響；western boltting結(jié)果顯示RB誘導(dǎo)中LC3B表達(dá)上調(diào),并促進(jìn)LC3BII的生成；免疫熒光顯示RB作用后,PC3細(xì)胞中出現(xiàn)點(diǎn)狀LC3B聚集。2.抑制自噬促進(jìn)RB誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。采用siRN A技術(shù)和小分子抑制劑3-MA或氯喹抑制自噬過程,顯著抑制細(xì)胞存活率,并促進(jìn)RB誘導(dǎo)的PC3細(xì)胞死亡,說明RB誘導(dǎo)保護(hù)性自噬,延遲前列腺癌細(xì)胞死亡。3.RB誘導(dǎo)線粒體損傷和ROS產(chǎn)生,并引起線粒體自噬。RB降低PC3和LNCaP細(xì)胞中線粒體膜電位,并呈時間依賴性,24h時膜電位均下降超過90%,導(dǎo)致線粒體嚴(yán)重?fù)p傷；通過流式細(xì)胞術(shù)顯示,RB處理PC3和LNCaP細(xì)胞后,誘導(dǎo)ROS水平發(fā)生時間依賴性上升,24h時升高3倍以上；電鏡觀察發(fā)現(xiàn)RB處理PC3細(xì)胞后,線粒體過度腫脹,出現(xiàn)自噬泡和自噬溶酶體,且發(fā)現(xiàn)線粒體被自噬溶酶體包裹。4.RB通過阻斷PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)自噬。RB能夠抑制Akt及下游作用蛋白mTOR的磷酸化水平,從而通過PI3K/Akt/mTOR信號通路激活自噬。二、MA1通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激激活A(yù)MPK/mTOR信號通路而誘導(dǎo)致死性自噬1.MA1誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3B表達(dá)與LC3BII的形成。western boltting與定量PCR結(jié)果顯示MA1誘導(dǎo)LC3B表達(dá)上調(diào),并促進(jìn)LC3BII的生成,而對其它自噬相關(guān)基因Atg5,Atg7口Beclinl表達(dá)無影響；免疫熒光顯示RB作用后,PC3細(xì)胞中出現(xiàn)大量點(diǎn)狀LC3B聚集。2.采用小分子抑制劑3-MA抑制自噬,部分逆轉(zhuǎn)MA1介導(dǎo)的細(xì)胞死亡,說明MA1誘導(dǎo)致死性自噬。3.MA1通過AMPK/mTOR信號通路誘導(dǎo)自噬。MA1作用后,AMPK顯著活化,進(jìn)而其下游作用蛋白mTOR磷酸化水平被抑制,而mTOR途徑的另一上游信號Akt無變化。4.MA1通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激激活A(yù)MPK/mTOR通路和自噬。MA1降低PC3和LNCaP細(xì)胞線粒體膜電位,呈時間依賴性,導(dǎo)致線粒體損傷；MA1誘導(dǎo)PC3和LNCaP細(xì)胞中ROS快速產(chǎn)生和ATP急劇消耗,并引起抗氧化蛋白SOD2,GSTP1和DJ-1過表達(dá)；采用小分子抗氧化劑VC和NAC能夠部分逆轉(zhuǎn)MA1介導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制；采用siRNA技術(shù)敲除SOD2后,LC3II水平上調(diào)且促進(jìn)細(xì)胞死亡,通過pEGFP-N1-SOD2質(zhì)粒使SOD2過表達(dá)后,MA1誘導(dǎo)的LC3BII水平發(fā)生下調(diào)且部分逆轉(zhuǎn)細(xì)胞死亡,說明線粒體ROS累積和ATP消耗誘導(dǎo)的AMPK/mTOR信號通路參與MA1介導(dǎo)的自噬�；谝陨系谝缓偷诙糠值膶�(shí)驗(yàn)結(jié)果,由于MA1能夠誘導(dǎo)壞死和炎癥反應(yīng)而具有較大的細(xì)胞毒性,因此我們在將在后續(xù)部分著重研究RB的抗腫瘤作用機(jī)制。第三部分Retigeric acid B通過阻斷NF-κB信號通路抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移NF-κB是前列腺癌多種發(fā)病因素下游的一個共同的關(guān)鍵環(huán)節(jié),激活NF-κB信號引起腫瘤細(xì)胞的增值、浸潤和轉(zhuǎn)移。在經(jīng)典NF-κB信號傳導(dǎo)途徑中,靜息狀態(tài)下,典型NF-κB二聚體(p50/p65)大部分與細(xì)胞質(zhì)中的IκBa結(jié)合而以無活性的狀態(tài)存在。各種信號通過降解IκBα的方式來活化NF-κB, IκBα的絲氨酸32、36位在IκBs激酶IKK的催化作用下發(fā)生磷酸化而被蛋白酶體泛素化降解,形成p50-p65二聚體,原先掩蓋的核定位信號暴露,且p65亞基被磷酸化,促進(jìn)核定位和轉(zhuǎn)錄活性,最終誘導(dǎo)目標(biāo)基因的大量表達(dá)。基于第一和第二部分研究發(fā)現(xiàn)RB對前列腺癌細(xì)胞具有抑制增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的能力,并顯著抑制Akt信號,在本部分中,我們深入研究了RB對雄激素非依賴型PC3和DU145細(xì)胞中Akt下游NF-κB信號通路的影響及RB通過NF-κB發(fā)揮增殖和侵襲轉(zhuǎn)移抑制活性的功能機(jī)制,并通過動物模型證明RB的體內(nèi)抗腫瘤作用。一、RB抑制腫瘤細(xì)胞p65磷酸化1.RB抑制前列腺癌細(xì)胞PC3和DU145中p65磷酸化水平,并呈濃度和時間依賴性；RB對p65總蛋白和mRNA的表達(dá)影響較小。2.RB對PC3和DU145細(xì)胞中p50與p52表達(dá)的無影響,說明RB對NF-κB的作用主要靶向經(jīng)典通路。3.RB抑制其他癌細(xì)胞的p65磷酸化水平,包括人肝癌細(xì)胞HepG2、人骨髓白血病細(xì)胞K562和其阿霉素耐藥株K562/AO2,而對人卵巢癌癥SKOV3和人肺腺癌A549細(xì)胞影響較小。二.RB抑制前列腺癌細(xì)胞中NF-κB核定位與轉(zhuǎn)錄活性,同時阻斷IκBα的降解1.RB抑制p65核定位。Western blottiong和免疫熒光結(jié)果顯示,RB濃度依賴性降低PC3細(xì)胞核中磷酸化p65的水平,而在未經(jīng)RB處理的細(xì)胞中p65在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均廣泛存在。2.EMSA結(jié)果顯示RB濃度依賴性下調(diào)PC3細(xì)胞內(nèi)NF-κB的DNA結(jié)合能力。3.RB抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。通過熒光素酶報告基因活性檢測,RB抑制PC3和DU145細(xì)胞中持續(xù)活化的以及LNCaP細(xì)胞中脂多糖誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性。3.RB抑制IκBα的磷酸化及其降解。Western blottiong顯示RB處理導(dǎo)致PC3和DU145細(xì)胞中IκBα總蛋白過表達(dá),IκBα磷酸化水平隨之降低,呈濃度和時間依賴性；體外蛋白酶體活性測定顯示,RB并未對重組20S蛋白酶體活性發(fā)揮抑制作用,說明RB可能通過抑制上游IKK激酶活性而抑制IκBα降解。三、RB通過阻斷NF-κB通路下調(diào)NF-κB目的基因的表達(dá),抑制細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移1.RB下調(diào)NF-κB目的基因的表達(dá)。Western blotting和定量PCR結(jié)果顯示,RB濃度依賴性降低PC3和DU145細(xì)胞中bcl-xL、bcl-2、survivin和cyclin D1的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平。2.基因表達(dá)譜驗(yàn)證RB對NF-κB目的基因的影響,數(shù)據(jù)顯示RB抑制PC3細(xì)胞中NF-κB信號調(diào)控的多種與細(xì)胞增殖和生存、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)。3NF-κB通路參與RB的抗腫瘤作用。通過轉(zhuǎn)染p65表達(dá)質(zhì)粒提高PC3和DU145細(xì)胞中p65的表達(dá)和磷酸化水平后,RB誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡被部分逆轉(zhuǎn)且PARP剪切形式減少；利用siRNA技術(shù)敲低p65的表達(dá),PC3和DU145細(xì)胞的存活率顯著降低。四、RB通過活化凋亡途徑及抑制p65磷酸化發(fā)揮體內(nèi)抑瘤作用1.RB抑制體外鼠前列腺癌細(xì)胞RM-1增殖與p65磷酸化。2.RB具有顯著的體內(nèi)抗腫瘤活性。構(gòu)建C57BL/6鼠的RM-1同種移植腫瘤模型,RB處理組腫瘤體積和重量顯著降低；腫瘤組織TUNEL染色結(jié)果顯示,RB處理組的腫瘤組織中可見明顯的染色陽性凋亡細(xì)胞；HE染色則顯示了腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化,表明RB能夠提高腫瘤組織的細(xì)胞凋亡率。3.RB影響腫瘤組織中NF-κB以及凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)。Western blotting結(jié)果表明,RB誘導(dǎo)腫瘤組織中PARP剪切,抑制Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá),并上調(diào)Bax水平；Western blotting和免疫熒光結(jié)果顯示,RB顯著抑制p65磷酸化和核定位。第四部分Retigeric acid B通過靶向Topoisomerase Ⅱα誘導(dǎo)DNA損傷促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞死亡DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerases,Topo)普遍存在于細(xì)胞核,能夠催化DNA鏈的斷裂和結(jié)合,從而控制DNA的拓?fù)錉顟B(tài)。在多個對生命活動至關(guān)重要的生物學(xué)過程中,如DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組、修復(fù)及染色體分離等,拓?fù)洚悩?gòu)酶通過催化誘導(dǎo)瞬時的DNA單鏈斷裂(SSBs)或雙鏈斷裂(DSBs)實(shí)現(xiàn)DNA局部拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的互變而發(fā)揮作用。多種化療藥物的抗腫瘤活性與其對酶-DNA可分裂復(fù)合物的穩(wěn)定性相關(guān),通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶-DNA共價化合物形成及誘導(dǎo)染色體和DNA損傷。ATF3(activating transcription factor 3)屬于ATF/CREB轉(zhuǎn)錄因子家族。ATF3是應(yīng)激誘導(dǎo)基因,在正常細(xì)胞中其表達(dá)維持較低水平；當(dāng)DNA損傷、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在內(nèi)的多種應(yīng)激信號作用于細(xì)胞時,ATF3可被迅速誘導(dǎo)表達(dá),以維持細(xì)胞在應(yīng)激條件下的基因組完整性和內(nèi)穩(wěn)態(tài)。然而,根據(jù)環(huán)境的不同,在持續(xù)或過強(qiáng)的應(yīng)激狀態(tài)下,ATF3可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。基于第一和第二部分研究發(fā)現(xiàn)RB誘導(dǎo)細(xì)胞S期阻滯、抑制DNA合成,并通過線粒體損傷而促進(jìn)ROS累積,均提示RB誘導(dǎo)DNA損傷,同時因其他五環(huán)三萜酸類已被證明具有Topo Ⅱ抑制活性,因此在這一部分中我們進(jìn)一步分析RB誘導(dǎo)DNA損傷和直接靶向Topo Ⅱ的可能性,及DNA損傷應(yīng)答信號在RB誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞死亡中發(fā)揮的重要作用。一、RB誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞DNA損傷并直接抑制Topo Ⅱα活性1.RB誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞DNA損傷。彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明RB顯著誘導(dǎo)PC3和LNCaP細(xì)胞發(fā)生DNA損傷,呈時間依賴性。同時western blotting顯示RB時間依賴性上調(diào)DNA損傷標(biāo)志蛋白yH2AX水平,而H2AX總蛋白水平無明顯變化。2.RB抑制Topo Ⅱα活性。通過體外kinetoplast DNA解聯(lián)檢測,RB濃度依賴性抑制Topo Ⅱα活性；分子對接技術(shù)顯示RB與Topo Ⅱα的潛在結(jié)合位點(diǎn)：RB的功能基團(tuán)羧基中的羰基氧和羥基中的羥基氧分別與水分子與的賴氨酸798位通過疏水作用相結(jié)合；RB中的羧基與賴氨酸798位也有離子間的相互作用。3.RB對拓?fù)洚悩?gòu)酶家族基因表達(dá)水平的影響較弱。基因表達(dá)譜、定量PCR和western blotting分析表明RB作用可輕度抑制PC3細(xì)胞中TOP2A和TOP3A的mRNA和蛋白的表達(dá)。二、RB通過活化ATM/ATR途徑誘導(dǎo)DNA損傷應(yīng)答信號1.RB激活A(yù)TM/ATR信號網(wǎng)絡(luò)。通過時相研究,RB作用早期激活A(yù)TM/ATR的效應(yīng)蛋白p53、Chk1和Chk2,繼而活化下游底物Cdc25A和Cdc25C,從而對細(xì)胞周期和生存發(fā)揮作用；特異性ATM抑制劑Ku55933阻斷RB介導(dǎo)的yH2AX和phosphor-Chk2水平上調(diào)；由于細(xì)胞類型的不同,在PC3和LNCaP中,RB對ATM/ATR信號通路的調(diào)控方式具有時間差異。2.ATM/ATR通路參與RB誘導(dǎo)的DNA損傷和細(xì)胞凋亡。在PC3和LNCaP細(xì)胞中,ATM/ATR的廣譜抑制劑咖啡因處理后幾乎完全阻斷了RB誘導(dǎo)H2AX磷酸化水平及PARP的剪切；且RB誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡被部分逆轉(zhuǎn)。三、RB抑制前列腺癌細(xì)胞DNA修復(fù)1、RB下調(diào)DNA修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)水平�；虮磉_(dá)譜和qPCR結(jié)果顯示多種與DNA損傷反應(yīng)和DNA復(fù)制的基因在RB作用后下調(diào)且后期變化顯著;western blotting檢測DNA修復(fù)相關(guān)蛋白的蛋白表達(dá),BRCA1被早期激活,Rad51和Ku86則在后期下降約2倍,而Ku70的表達(dá)沒有明顯變化。2、RB抑制DNA末端連接活性。通過體外DNA末端連接活性檢測,RB處理顯著抑制二聚體及多聚體的形成,表明RB能夠顯著抑制核蛋白中DNA修復(fù)酶類的催化活性。四、RB誘導(dǎo)的DNA損傷效應(yīng)與ATF3及其他應(yīng)激反應(yīng)基因變化有關(guān)1.RB誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)基因發(fā)生變化�；虮磉_(dá)譜顯示RB作用對應(yīng)激及DNA損傷相關(guān)基因表達(dá)的總體變化,定量PCR技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證,轉(zhuǎn)錄因子如ATF3、 ATF4、ATF6及KLF6、EGR1、ETS1,應(yīng)激反應(yīng)基因PTGS2、促凋亡基因如DDIT3、 DDIT4、GADD45A、DR5等發(fā)生顯著變化；其中ATF3尤為顯著,在PC3和LNCaP細(xì)胞中分別上調(diào)24.13和38.63倍；western blotting結(jié)果顯示RB顯著誘導(dǎo)ATF3的蛋白表達(dá)。2.RB促進(jìn)ATF3的轉(zhuǎn)錄活性。熒光素酶報告基因檢測表明,RB顯著降低PC3和LNCaP細(xì)胞中ATF3的啟動子活性；從而增強(qiáng)ATF3的轉(zhuǎn)錄以促進(jìn)表達(dá)。3.LNCaP細(xì)胞中p53活化增強(qiáng)RB誘導(dǎo)的ATF3表達(dá)。轉(zhuǎn)染突變型p53表達(dá)質(zhì)粒于LNCaP細(xì)胞后,RB對ATF3表達(dá)的誘導(dǎo)作用顯著減弱。4.RB促進(jìn)ATF3發(fā)生核定位。western blotting結(jié)果顯示,RB促進(jìn)PC3和LNCaP細(xì)胞中ATF3在細(xì)胞核中聚集,胞液中相對減少,呈時間依賴性,ATF3核定位有助于發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子活性。五、ATF3通過活化凋亡相關(guān)基因促進(jìn)RB介導(dǎo)的細(xì)胞死亡1.抑制ATF3的表達(dá)逆轉(zhuǎn)RB誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。利用siRNA技術(shù)抑制ATF3的表達(dá),RB作用于PC3和LNCaP細(xì)胞后,存活率顯著提高,凋亡細(xì)胞減少；ATF3敲除未改變H2AX的磷酸化水平,表明ATF3過表達(dá)不能導(dǎo)致DNA損傷；RB介導(dǎo)的ATF3過表達(dá)及核定位并不能被caspase抑制劑z-VAD-fmk所阻斷,表明ATF3的誘導(dǎo)并不是caspase激活的下游事件。2.抑制ATF3導(dǎo)致其下游促凋亡目的基因的表達(dá)變化。敲除ATF3后,與細(xì)胞死亡相關(guān)的重要調(diào)控因子DDIT、GADD45A和DR5 mRNA水平顯著下降,與細(xì)胞周期調(diào)控因子CDC25A明顯上調(diào),從而阻斷RB介導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制與細(xì)胞死亡作用。3.RB通過KLF6促進(jìn)ATF3的表達(dá)。通過ATF3啟動子熒光素酶報告基因檢測,轉(zhuǎn)錄因子EGR1、ETS1、E2F1、Sp1、STAT3、KLF6、ETV1和ERG1中,而僅KLF6顯著促進(jìn)RB誘導(dǎo)的ATF3啟動子活性,說明RB通過誘導(dǎo)KLF6促進(jìn)ATF3的表達(dá)。第五部分結(jié)論和創(chuàng)新點(diǎn)一、結(jié)論1.通過對多種天然小分子化合物的抗腫瘤和自噬誘導(dǎo)活性篩選,確定五環(huán)三萜酸類化合物Retigeric acid B和環(huán)肽類化合物Malformin A1均具有顯著的前列腺癌細(xì)胞抑制活性和誘導(dǎo)DNA損傷能力,且對自噬具有不同程度的誘導(dǎo)活性。2.Retigeric acid B通過誘導(dǎo)線粒體損傷從而導(dǎo)致凋亡和線粒體自噬,后者對細(xì)胞具有保護(hù)性作用,延遲前列腺癌細(xì)胞死亡；Malformin A1通過誘導(dǎo)線粒體損傷、ROS累積和ATP急劇下降,激活A(yù)MPK/mTOR信號通路,從而誘發(fā)致死性自噬。3.Retigeric acid B通過阻斷NF-κB信號通路抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移,并具有體內(nèi)抗腫瘤活性,顯著抑制C57BL/6鼠中前列腺癌的發(fā)展。4. Retigeric acid B通過靶向抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ誘導(dǎo)DNA損傷,激活A(yù)TM/ATR/Chk信號網(wǎng)絡(luò)；作用后期抑制DNA修復(fù)并促進(jìn)應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子ATF3高表達(dá)與核定位,從而激活其下游促凋亡信號而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞死亡。二、創(chuàng)新點(diǎn)1.首次報道五環(huán)三萜酸類化合物Retigeric acid B的抗腫瘤活性,闡明Retigeric acid B抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移、及誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的多作用機(jī)制,并明確了Retigeric acid B對動物腫瘤模型的體內(nèi)抑瘤活性。2.首次報道Retigeric acid B的直接作用靶點(diǎn)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ,動態(tài)分析Retigericacid B誘導(dǎo)DNA損傷、抑制DNA修復(fù)和激活應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子ATF3對細(xì)胞死亡的促進(jìn)作用,闡明Retigeric acid B誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的完整作用機(jī)制。3.首次報道環(huán)肽類化合物Malformin A1的自噬誘導(dǎo)作用,并闡明其誘導(dǎo)自噬的信號機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.25

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 顧方六;Changing constituents of genitourinary cancer in recent 50 years in Beijing[J];Chinese Medical Journal;2003年09期

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本文編號：1206354